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腫瘤微環(huán)境（TME）通過代謝重編程影響腫瘤的異質(zhì)性、侵襲性和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致乳酸增加和免疫抑制性TME的形成。為消耗乳酸，開發(fā)了乳酸氧化酶（LOx）等方法，但LOx受缺氧環(huán)境限制，氧化應(yīng)激效應(yīng)也可能不足以達(dá)到最佳治療效果，因此改善腫瘤氧合至關(guān)重要。納米酶因其類酶活性在腫瘤治療中有潛力。將LOx與具有催化功能的納米酶結(jié)合，有望增強(qiáng)乳酸催化和細(xì)胞毒性·OH的生成，提高治療效果。光聲（PA）成像可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)催化過程中的分子變化，為腫瘤催化治療的臨床應(yīng)用提供支持。

基于上述背景，深圳大學(xué)黃鵬團(tuán)隊(duì)研究構(gòu)建了雙酶驅(qū)動(dòng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)平臺(tái)（ILH），由修飾透明質(zhì)酸的銥金屬納米酶和乳酸氧化酶（LOx）組成。LOx通過氧化乳酸生成H?O?，降低乳酸水平，從而將免疫抑制性TME轉(zhuǎn)化為免疫反應(yīng)性，促使巨噬細(xì)胞從M2型向M1型極化。銥納米酶具類CAT活性，分解H?O?生成O?，緩解腫瘤缺氧，并通過PA成像監(jiān)測(cè)氧合變化。其類POD和GSHOx活性在酸性環(huán)境中生成細(xì)胞毒性·OH并消耗GSH，削弱腫瘤抗氧化防御，激活免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）。此外，銥納米酶的光熱性能增強(qiáng)級(jí)聯(lián)催化效果，并賦予ILH強(qiáng)PA響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)控級(jí)聯(lián)治療過程。該文章于2024年10月21日以《Dual Enzyme-Driven Cascade Reactions Modulate Immunosuppressive Tumor Microenvironment for Catalytic Therapy and Immune Activation》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.4c07374）。

研究示意圖

（1）ILH的制備與表征

   通過濕化學(xué)還原法合成了聚烯丙胺功能化的銥金屬納米酶（Ir-PAH）。HAADF-STEM和TEM圖像顯示Ir-PAH呈層狀結(jié)構(gòu)，平均直徑約為100 nm（圖1a,b），且高倍率下可見多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖1c）。AC-STEM顯示晶格間距為0.21 nm，對(duì)應(yīng)Ir的面心立方結(jié)構(gòu)（111）晶面（圖1d）。AFM數(shù)據(jù)顯示Ir-PAH厚度約為6.3 nm（圖1e,f）。負(fù)載LOx和HA后，Ir金屬納米酶的形貌無明顯變化，元素分布圖顯示硫元素均勻分布，表明LOx成功負(fù)載（圖1g）。XPS光譜確認(rèn)了Ir-PAH的形成（圖1h）。DLS測(cè)得Ir-PAH水動(dòng)力直徑增至150.8 ± 3.7 nm，經(jīng)HA修飾后約為168.3 ± 5.1 nm（圖1i）。表面電位測(cè)量表明ILH的zeta電位為?27.5 ± 0.7 mV，而Ir-PAH為36.5 ± 2.6 mV，歸因于HA的存在（圖1j）。

圖1. (a) Ir-PAH 的 TEM 圖像；(b) Ir-PAH 的 HAADF-STEM 圖像；(c) Ir-PAH 的 HAADF-STEM 圖像，箭頭表示孔隙的存在；(d) Ir-PAH 的高分辨率 TEM 圖像，顯示晶格距離；(e) AFM 圖像；(f) 相應(yīng)的 Ir-PAH 高度剖面圖；(g) ILH 的元素映射；(h) Ir-PAH 的 XPS 光譜；(i) Ir-PAH、Ir@LOx 和 ILH 的大小分布；(j) Zeta 電位

（2）ILH的光熱性能與多酶活性

紫外–可見–近紅外（UV–vis–NIR）光譜顯示ILH在NIR-II區(qū)具有顯著吸收，且吸收強(qiáng)度隨濃度增加（圖2a）。1064 nm處的消光系數(shù)為7.15 L g?1 cm?1。激光照射下，ILH溶液溫度顯著升高，隨濃度增加而增強(qiáng)（圖2b,c）。ILH展現(xiàn)出良好的光熱穩(wěn)定性，NIR-II光熱轉(zhuǎn)換效率為39.7%，優(yōu)于許多用于NIR-II光熱治療的制劑。多次激光開/關(guān)循環(huán)后，ILH的光熱特性和形貌無明顯變化，表明其光熱穩(wěn)定性良好。Ir-PAH的GSHOx樣活性通過DTNB指示劑驗(yàn)證，結(jié)果顯示其消耗GSH并生成Ir3?，進(jìn)一步氧化為Ir??以消耗GSH（圖2d,e）。Ir-PAH的CAT樣活性評(píng)估顯示H?O?引入導(dǎo)致溶解氧（DO）逐漸增加，且激光照射下DO產(chǎn)量提升1.42倍（圖2f）。Ir-PAH對(duì)H?O?的轉(zhuǎn)化符合米氏動(dòng)力學(xué)，Km值為44.86 mM。通過基于TMB的比色法測(cè)試了Ir-PAH的POD樣活性，表現(xiàn)出米氏動(dòng)力學(xué)，Km值為24.12 mM，Vmax為0.57 μM s?1（圖2g,h）。激光照射下TMB氧化增加1.56倍。為評(píng)估ILH的級(jí)聯(lián)催化性能，通過ESR檢測(cè)生成的·OH，結(jié)果表明ILH在乳酸存在下可生成·OH，且激光照射下·OH產(chǎn)量增加（圖2i）。在模擬體液中，TEM圖像顯示Ir金屬納米酶在12天內(nèi)逐漸降解，產(chǎn)生超小Ir納米顆粒，表明其具有良好生物降解性（圖2j）。

圖2. (a) 不同濃度 ILH 的紫外-可見-近紅外光譜；(b) 1064 nm 激光照射和不照射時(shí)不同濃度 ILH 水溶液的光熱譜圖；(c) 相應(yīng)的熱像圖；(d) DTNB 與谷胱甘肽和不同濃度的 Ir-PAH 在不同時(shí)間孵育的紫外可見光譜；(e) GSH 處理前后 Ir-PAH 的 Ir 4f XPS 光譜。加入 GSH 后，Ir 4f 峰向結(jié)合能較低的方向移動(dòng)，表明生成了更多的 Ir3?；(f) 不同組（H?O?、H?O? + Ir-PAH 和 H?O? + Ir-PAH + 激光）的產(chǎn)氧量。H?O?: 1 M, Ir-PAH: 10 μg·mL?1；(g) 室溫下 Ir-PAH 的 cat 樣活性動(dòng)力學(xué)測(cè)定；(h) 室溫下 Ir-PAH pod 樣活性的動(dòng)力學(xué)測(cè)定；(i) 用乳酸溶液（20 mM）孵育 ILH，激光照射或不照射時(shí)的 ESR 光譜；(j) 在 37 ℃ 的 SBF 培養(yǎng)基（pH = 7.4）中孵育不同時(shí)間后的 ILH 的 TEM 圖像

（3）ILH的靶向攝取與抗腫瘤作用

       天然透明質(zhì)酸（HA）因其優(yōu)異的生物功能、生物相容性和生物降解性，能結(jié)合過表達(dá)CD44受體的腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)特異性腫瘤靶向遞送。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，Ir@HA（IH）對(duì)4T1細(xì)胞毒性較低，細(xì)胞存活率高于80%；而ILH的細(xì)胞毒性顯著增加，激光照射進(jìn)一步提高其毒性（圖3a）。細(xì)胞遷移分析表明，ILH和激光照射可顯著抑制4T1細(xì)胞遷移，ILH+激光組的遷移速率最低（圖3b,c）。ILH+激光組在共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和流式細(xì)胞術(shù)中顯示出強(qiáng)綠色熒光信號(hào)，表明ROS生成（圖3d,e），且通過HPF檢測(cè)到的·OH生成進(jìn)一步驗(yàn)證了Ir類金屬納米酶的POD樣活性（圖3f）。通過比率熒光探針C11-BODIPY581/591檢測(cè)脂質(zhì)過氧化（LPO），ILH+激光組顯示出較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，表明ROS增強(qiáng)引發(fā)的LPO（圖3g）。此外，ILH+激光組中更高的JC-1單體比例（60.2%）證明了線粒體損傷效應(yīng)（圖3h）。天然透明質(zhì)酸（HA）因其優(yōu)異的生物功能、生物相容性和生物降解性，能結(jié)合過表達(dá)CD44受體的腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)特異性腫瘤靶向遞送。

圖3. (a) 在 1064 nm 激光照射（0.6 W·cm?2, 5 min）下，不同濃度 IH 或 ILH 孵育 4T1 細(xì)胞后的相對(duì)存活率；(b) 采用高含量成像系統(tǒng)捕獲不同處理后的 4T1 細(xì)胞顯微圖像，并用 Harmony 軟件進(jìn)行處理；(c) 4T1 細(xì)胞遷移率的定量分析。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，n = 3；(d) 流式細(xì)胞術(shù)分析不同處理后 4T1 細(xì)胞 ROS 生成情況；(e) DCFH-DA 染色 4T1 細(xì)胞的共聚焦圖像；(f) 不同處理后的 HPF 圖像。標(biāo)尺：20 μm；(g) 不同處理后 LPO 染色 4T1 細(xì)胞的共聚焦圖像；(h) 不同處理后 j-單體和 j-聚集體的流式細(xì)胞術(shù)分析

（4）ILH對(duì)TAMs極化的體外調(diào)控

      乳酸消耗誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，ILH在體外有效減少乳酸濃度，并通過共培養(yǎng)4T1細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M2型向M1型轉(zhuǎn)變（圖4a, b）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，ILH+激光組M1型巨噬細(xì)胞比例增加（圖4c），與RAW264.7細(xì)胞結(jié)果一致。IH通過催化H2O2分解為O2緩解腫瘤缺氧（圖4d,h），NIR-II激光增強(qiáng)該過程，并降低HIF-1α水平（圖4e,i）。光熱增強(qiáng)催化療法產(chǎn)生ROS，誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）。ILH+激光組顯著增強(qiáng)CRT暴露和HMGB1釋放，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟并激活免疫反應(yīng)（圖4f, g, j, k）。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示ILH+激光組中HMGB1、CRT表達(dá)和ATP分泌水平顯著提高，表明其引發(fā)了強(qiáng)烈的ICD反應(yīng)。

圖4. (a) 乳酸誘導(dǎo)的 M2 型巨噬細(xì)胞復(fù)極化過程中形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)變示意圖；(b) 免疫熒光圖像描繪了 ILH 處理后 MCTS 內(nèi)巨噬細(xì)胞的空間排列（紅色：M1 巨噬細(xì)胞，綠色：M2 巨噬細(xì)胞，藍(lán)色：細(xì)胞核）；(c) 對(duì)抗 CD86 染色的 RAW264.7 細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析；(d) 低氧條件下（1% O?, 5% CO?, 94% N?）不同處理后 [Ru(dpp)?]Cl? 染色的 4T1 細(xì)胞代表性共聚焦圖像；(e) 缺氧條件下不同處理后的 4T1 細(xì)胞共聚焦圖像，用 phalloidin（綠色）和抗 HIF-1α（紅色）染色；(f) CRT 表達(dá)的共聚焦圖像；(g) HMGB1 蛋白釋放；(h) [Ru(dpp)?]Cl?、(i) HIF-1α、(j) CRT 和 (k) HMGB1 在不同處理（PBS、激光、LOx、IH、IH + 激光、ILH 和 ILH + 激光）后熒光信號(hào)的定量

（5）In Vivo 3D PA成像引導(dǎo)的級(jí)聯(lián)催化過程

考慮到Ir-PAH在激光照射下的光熱特性，該研究評(píng)估了IH和ILH的PA成像能力。在體外實(shí)驗(yàn)中，IH和ILH在NIR-II區(qū)域的PA信號(hào)強(qiáng)度與其濃度呈正比（圖5a, b）。由于ILH與OxyHb和DeoxyHb在NIR范圍的PA吸收光譜差異，可以通過檢測(cè)其特征信號(hào)區(qū)分體內(nèi)級(jí)聯(lián)催化過程的動(dòng)態(tài)分子事件。在小鼠腫瘤模型中，IH或ILH通過靜脈注射后，腫瘤部位的PA信號(hào)強(qiáng)度在8小時(shí)后增加約2.8倍（圖5c,d），顯示了ILH在PA成像中的潛力。3D PA成像結(jié)合OxyHb和DeoxyHb的PA/US圖像（圖5e）及定量值（圖5f,g）表明，PBS組的PA信號(hào)穩(wěn)定，而IH組的OxyHb信號(hào)顯著增強(qiáng)，約為初始值的3.5倍，同時(shí)DeoxyHb信號(hào)減弱，表明IH通過催化H₂O₂生成O₂來改善腫瘤缺氧。ILH組的OxyHb信號(hào)強(qiáng)度約為IH組的76.3%，可能是由于LOx催化乳酸時(shí)部分O₂被消耗。通過多波長(zhǎng)PA成像實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤內(nèi)血氧飽和度（sO₂）變化，1064 nm激光照射進(jìn)一步增強(qiáng)ILH的CAT樣活性，提升sO₂水平，從而緩解腫瘤微環(huán)境（TME）的缺氧狀態(tài)（圖5h）。

圖5. (a) 970 nm 激光激活下不同濃度 IH 或 ILH 溶液的 PA 圖像；(b) 相應(yīng)的 PA 值；(c) 靜脈注射 IH 或 ILH 后腫瘤組織隨時(shí)間變化的 3D PA/US 圖像；(d) 隨時(shí)間變化的 PA 振幅量化；(e) 靜脈注射 PBS、IH 或 ILH 后腫瘤組織中 DeoxyHb 和 OxyHb 的 3D 渲染 PA/US 圖像；(f) 測(cè)定腫瘤部位的 OxyHb 水平；(g) 腫瘤部位脫氧血紅蛋白定量；(h) 激光照射和靜脈注射 ILH 后小鼠腫瘤組織中 sO? 水平的 3D PA/US 圖像；(i) 腫瘤組織中 sO? 值的定量測(cè)定

（6）In Vivo生物安全評(píng)估、級(jí)聯(lián)催化治療與免疫激活

基于ILH的體外治療效果，該研究進(jìn)一步考察了其體內(nèi)抗腫瘤效果。在4T1腫瘤模型中，借助體內(nèi)PA成像，IH和ILH注射8小時(shí)后對(duì)腫瘤組織進(jìn)行NIR-II激光照射。在1064 nm激光下，ILH處理的腫瘤溫度升高至47.3 °C（圖6a,b）。4T1腫瘤模型被分為PBS、激光、LOx、IH、IH+激光、ILH和ILH+激光7組。結(jié)果顯示，ILH+激光組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率(TGI)達(dá)90.1%，表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤效果（圖6c,d），且治療期間體重?zé)o顯著變化（圖6e），證明治療的安全性。H&E和Ki-67染色表明，ILH+激光組有顯著的組織損傷和細(xì)胞增殖抑制，TUNEL染色結(jié)果顯示該組凋亡信號(hào)最強(qiáng)（圖6g,h）。此外，肺部H&E染色顯示，ILH+激光組肺轉(zhuǎn)移灶減少92.1%，表明其強(qiáng)大的抗轉(zhuǎn)移效果（圖6i,j）。這些結(jié)果表明，光熱增強(qiáng)的催化治療具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和激活免疫系統(tǒng)的潛力，有助于阻止腫瘤轉(zhuǎn)移。

圖6. (a) 不同處理下腫瘤部位的光熱成像圖像；(b) 相應(yīng)的溫度變化。激光參數(shù)：1064 nm，0.6 W·cm?2，10 min；(c) 指定治療后的腫瘤生長(zhǎng)曲線；(d) 腫瘤平均重量；(e) 小鼠體重；(f) 指示治療后小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線；(g) 指示治療后腫瘤切片的 H&E、Ki-67 和 TUNEL 染色圖像；(h) 指定治療后腫瘤組織 TUNEL 染色圖像陽性率定量；(i) 代表性肺組織的 H&E 染色圖像。比例尺：2 mm。如箭頭所示的放大圖像；(j) 各實(shí)驗(yàn)組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)

（7）免疫抑制TME調(diào)控與免疫激活

該研究探索了ILH在抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移應(yīng)用中的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。4T1腫瘤模型及相關(guān)干預(yù)措施的具體方法如圖7a所示。實(shí)驗(yàn)證明，實(shí)體腫瘤中的缺氧和乳酸積累會(huì)引起巨噬細(xì)胞大量浸潤(rùn)，但這種浸潤(rùn)往往削弱巨噬細(xì)胞功能，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移。通過腫瘤切片的HIF-1α免疫熒光染色分析（圖7b,c），研究發(fā)現(xiàn)ILH顯著緩解了腫瘤缺氧狀態(tài)，下調(diào)HIF-1α表達(dá)，并提高了M1型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）的比例。ILH通過氧氣生成和乳酸消耗協(xié)同作用，有效調(diào)控了免疫抑制TME。

進(jìn)一步的流式細(xì)胞術(shù)分析表明，與對(duì)照組相比，ILH處理后M1/M2比值提高了約5.6倍（圖7d,g）。催化治療產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷，釋放的腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）被轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)，由樹突狀細(xì)胞（DCs）呈遞至T細(xì)胞，激發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。DCs成熟度的分析顯示，ILH+激光組中成熟DC比例較PBS組高出2.5倍（圖7e,h）。此外，CD8+ T細(xì)胞在腫瘤監(jiān)控中具有關(guān)鍵作用，而CD4+ T細(xì)胞則主要調(diào)控并協(xié)調(diào)其他免疫細(xì)胞，因此測(cè)定了治療后腫瘤組織中的CD4+和CD8+ T細(xì)胞比例（圖7f–j）。ILH和ILH+激光組均表現(xiàn)出顯著的T細(xì)胞浸潤(rùn)，ILH+激光組中CD3+CD8+ T細(xì)胞比例較PBS組增加4.2倍。最后，ELISA分析顯示，ILH+激光組小鼠血清中IFN-γ、IL-6和TNF-α水平分別提高了1.9倍、2.2倍和2.0倍（圖S26），表明ILH有效激活了抗腫瘤免疫反應(yīng)。

圖7. (a) 小鼠處理過程示意圖；(b) 不同處理后腫瘤組織 HIF-1α 表達(dá)的組織學(xué)染色圖；(c) 腫瘤組織內(nèi)巨噬細(xì)胞免疫熒光染色。藍(lán)色、綠色和紅色熒光分別表示細(xì)胞核、CD206 和 CD86；(d) 第 5 天不同處理后浸潤(rùn)腫瘤的 M2 和 M1 巨噬細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞術(shù)分析；(e) 不同處理后第 5 天成熟 DC 的代表性流式細(xì)胞術(shù)分析；(f) 以 CD3+ 細(xì)胞為門控，第 5 天不同治療后腫瘤中 CD8+ 和 CD4+ T 細(xì)胞的代表性流式細(xì)胞術(shù)分析；(g) 不同處理后巨噬細(xì)胞 M1/M2 比值；(h) 淋巴結(jié)成熟樹突狀細(xì)胞定量分析；(i) CD8+ T 細(xì)胞和 (j) CD4+ T 細(xì)胞在腫瘤中的定量百分比

研究小結(jié)：

綜上所述，該研究開發(fā)了一種雙酶驅(qū)動(dòng)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)平臺(tái)（ILH），具備免疫抑制TME調(diào)控能力，用于PA成像引導(dǎo)的催化治療。腫瘤內(nèi)氧氣生成與乳酸消耗的協(xié)同作用有效改善了免疫抑制TME，促使TAMs從M2型向M1型極化，從而激活抗腫瘤免疫。ILH顯著緩解了腫瘤缺氧，并催化產(chǎn)生了大量氧化應(yīng)激，最終誘導(dǎo)了ICD并激活抗腫瘤免疫。該方法在4T1異種移植模型中實(shí)現(xiàn)了90.1%的腫瘤抑制率（TGI）和92.1%的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)減少。含有Ir金屬納米酶的引入進(jìn)一步增強(qiáng)了級(jí)聯(lián)催化效率并實(shí)現(xiàn)了PA成像。通過3D多光譜PA成像監(jiān)測(cè)內(nèi)源分子信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)了級(jí)聯(lián)催化治療過程的實(shí)時(shí)體內(nèi)監(jiān)控。該研究展示了一種用于分子影像導(dǎo)航、腫瘤催化治療和免疫激活的納米平臺(tái)。