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     糖尿病是全球十大慢性代謝性疾病中的第一位，并伴有許多嚴(yán)重的并發(fā)癥。約20%的糖尿病患者創(chuàng)面愈合不良。過多的ROS，如過氧化氫（H₂O₂）、羥基自由基（-OH）和超氧陰離子（O^2-），已被證明可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而影響細(xì)胞活性和延緩傷口愈合。由于CeO₂表面存在豐富的氧空位，Ce³⁺和Ce⁴⁺可以可逆轉(zhuǎn)化，因此CeO₂可以作為一種ROS清除劑。此外，CeO₂材料可以刺激細(xì)胞增殖和遷移，在治療糖尿病傷口上顯示出巨大的潛力。細(xì)菌感染是阻礙糖尿病傷口愈合的另一個(gè)關(guān)鍵因素。光熱療法是替代傳統(tǒng)抗生素治療的一種方法，因此該研究選擇硫化鉬（MoS₂）這種光熱轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的光熱劑達(dá)高效抗菌的作用。同時(shí)，MoS₂可以通過與額外的ROS反應(yīng)來清除ROS。pH值與細(xì)菌感染和血管生成等生理過程有關(guān)。監(jiān)測傷口pH值可以明確傷口狀態(tài)，為細(xì)菌的感染提供早期預(yù)警?；谔剂孔狱c(diǎn)（CDs）的pH傳感器具有操作簡單、響應(yīng)速度快和生物相容性好的特點(diǎn)。因此，通過診療結(jié)合，實(shí)時(shí)監(jiān)測傷口組織的pH值變化，及時(shí)進(jìn)行精準(zhǔn)治療，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。

     針對上述問題，武漢理工大學(xué)戴紅蓮教授，通過酰胺化反應(yīng)構(gòu)建了硫辛酸修飾殼聚糖（LAMC）水凝膠，并將具有多巴胺結(jié)構(gòu)的氧化鈰-二硫化鉬納米顆粒（C@M@P）和水熱合成的碳量子點(diǎn)（CDs）一起負(fù)載到水凝膠中，從而開發(fā)出一種診斷和治療水凝膠（LAMC/CD-C@M@P）。通過引入CDs，該水凝膠在紫外光下表現(xiàn)出對pH的高度敏感性和可逆性。此外，水凝膠的圖像可以使用智能手機(jī)收集并轉(zhuǎn)換為傷口pH信號，為早期檢測細(xì)菌感染提供了一種方法。同時(shí)，LAMC/CD-C@M@P水凝膠對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有光熱抗菌能力，并具有顯著的抗氧化和抗炎能力，以緩解氧化應(yīng)激和減輕炎癥反應(yīng)。該成果于2024年04月21日以《A Multifunctional Hydrogel with Photothermal Antibacterial and Antioxidant Activity for Smart Monitoring and Promotion of Diabetic Wound Healing》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202402531）。

圖1.構(gòu)建糖尿病傷口愈合診斷和治療水凝膠的示意圖

（1）復(fù)合水凝膠的智能pH監(jiān)測能力

如圖1A所示，在紫外光（365 nm）下，水凝膠的熒光強(qiáng)度隨pH的變化而變化。利用波長290 nm ~ 350 nm的激發(fā)光評價(jià)LAMC/CD-C@M@P水凝膠的激發(fā)依賴性（圖1B）。隨著激發(fā)波長從290 nm增加到320 nm，熒光強(qiáng)度大大增強(qiáng)，在320 nm處達(dá)到最大。同時(shí)，隨著激發(fā)波長從330 nm增加到350 nm，熒光強(qiáng)度下降，并伴有紅移。隨后，當(dāng)激發(fā)光波長為365 nm時(shí)，評估水凝膠的pH敏感性。有趣的是，隨著pH值從4增加到9，熒光強(qiáng)度呈增加趨勢（圖1C）。進(jìn)一步的詳細(xì)研究了歸一化熒光強(qiáng)度與pH值的關(guān)系，結(jié)果表明，得到的線性曲線可以很好地?cái)M合（圖1D）。此外，CDs在不同pH值下的熒光強(qiáng)度變化具有高度可逆性（圖1E）。綜上所述，熒光強(qiáng)度隨pH值的線性變化有利于傷口狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測。為了克服肉眼下熒光強(qiáng)度變化的差異，將圖像轉(zhuǎn)換為RGB信號，構(gòu)建pH值與RGB值的對應(yīng)方程，通過智能方法輕松獲得pH值（圖1F）。在紫外光（365 nm）下，隨著pH的增加，R值逐漸減小，G值保持不變，B值逐漸增大。通過G+B與pH值的擬合得到相應(yīng)的方程（圖1G）。

圖2.水凝膠的智能pH監(jiān)測功能。A）水凝膠在紫外光（365 nm）下的熒光強(qiáng)度變化。B）水凝膠在不同激發(fā)波長下的熒光強(qiáng)度。C）水凝膠在不同pH值（365 nm激發(fā)波長）下的熒光強(qiáng)度。D）熒光強(qiáng)度與pH值之間的線性關(guān)系。E）水凝膠在pH值為4至9（365 nm激發(fā)波長）內(nèi)的可逆性。F）將圖像轉(zhuǎn)換成RGB信號。G）G+B與pH值的擬合曲線

（2）物理性質(zhì)和活性氧清除能力

通過搭接剪切強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)測量復(fù)合水凝膠的剪切黏結(jié)力（圖2A）。結(jié)果表明，隨著NPs的加入，粘附力增加（圖2B）。在圖2C中，與LAMC水凝膠相比，LAMC-P水凝膠的壓縮性能下降，主要是由于PDA的良好粘附性能，這導(dǎo)致水凝膠對外力的抵抗力下降。圖2D表明，LAMC水凝膠迅速溶脹，最終溶脹比為18.85±0.73。21天后，圖2E顯示，LAMC、LAMC-P、LAMC-C@P、LAMC-M@P、LAMC-C@M@P和LAMC/CDC@M@P的降解率分別為56.89±2.78%、62.93±1.48%、68.15±0.80%、46.54±2.91%、48.92±0.71%和55.22±1.80%。這種變化可能歸因于帶正電荷的P和CeO₂與LAMC中的羥基之間的相互作用，這可能導(dǎo)致水凝膠內(nèi)交聯(lián)密度的差異。如圖2F所示，LAMC水凝膠顯示出5.21±1.87%的H₂O₂清除能力，而LAMC-P、LAMC-C@P、LAMC-M@P、LAMC-C@M@P和LAMC/CDC@M@P水凝膠顯示出越來越高的清除能力，分別為38.10±0.48%、44.58±1.93%、40.85±4.48%、55.66±1.34%和55.29±0.32%。對于-OH和O^2-清除能力也觀察到類似的趨勢。在圖2G，H中，顯示了LAMC水凝膠顯示出分別為23.65±2.91%和22.19±6.33%的-OH和O^2-清除能力，并且對于LAMC/CD-C@M@P水凝膠，進(jìn)一步增加到53.67±0.86%和57.93±6.89%。

圖3.復(fù)合水凝膠的表征。A）粘合強(qiáng)度試驗(yàn)示意圖。B）水凝膠的粘合強(qiáng)度。C）復(fù)合水凝膠的可壓縮性。D）水凝膠在pH為7.4的PBS中的溶脹比。E）水凝膠在pH為7.4的PBS中的降解性能。水凝膠的ROS清除率：F）H₂O₂ 、G）-OH 和 H）O^2-

（3）光熱性能和近紅外輔助抗菌性能

在1.0w cm^-2的功率下，水凝膠的溫度逐漸升高，而LAMC水凝膠保持在25.0°C至26.7°C的溫度范圍內(nèi)(圖3A)。復(fù)合水凝膠的抗菌性能通過直接接觸菌液來測定。如圖3D所示，在對照組和對照組+ NIR組中，固體培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)了大量的活細(xì)菌菌落，表明NIR輻射對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌(的生長沒有影響。在LAMC組中，LAMC水凝膠對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別為25.83±6.43%和17.71±6.48%，這主要?dú)w因于帶正電荷的殼聚糖吸引了細(xì)菌的負(fù)電荷，破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性和流動性(圖3B-C)。在圖3E中，在對照組和對照組+ NIR組中，細(xì)菌保持光滑完整的球形或桿狀。當(dāng)用808 nm NIR處理LAMC/CD-C@M@P水凝膠10分鐘時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞膜被嚴(yán)重破壞，內(nèi)容物從細(xì)胞中流出。因此，C@M@P NPs產(chǎn)生的光熱效應(yīng)在抗菌過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，顯示出降低傷口感染風(fēng)險(xiǎn)的巨大潛力。

圖4.復(fù)合水凝膠的光熱和抗菌性能。A）水凝膠的光熱升溫曲線。B-D）金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抗菌實(shí)驗(yàn)中的圖像和定量數(shù)據(jù)。E）金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的SEM圖像

（4）生物相容性和細(xì)胞遷移

如圖4A所示，在第一天和第三天沒有觀察到明顯的細(xì)胞毒性。然而，L929細(xì)胞在所有水凝膠組中的存活率超過95%，顯示出復(fù)合水凝膠良好的生物相容性，活/死染色結(jié)果(圖4D)進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞相容性。細(xì)胞遷移是傷口愈合過程中的重要步驟。因此，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 (CCK-8)分析和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)來評估水凝膠對細(xì)胞遷移的影響(圖4B，E)。從圖4E可以看出，對照組和LMAC組的細(xì)胞遷移結(jié)果大體一致，而LAMC/CDC@M@P組在促進(jìn)細(xì)胞遷移方面表現(xiàn)出最佳影響。定量結(jié)果（圖4C）顯示，LAMC治療/CD-C@M@P水凝膠在24小時(shí)后導(dǎo)致細(xì)胞劃痕覆蓋率為65.24±1.13%，超過了對照組（37.07±2.16%）和LAMC組（43.19±2.27%）。

圖5.復(fù)合水凝膠的體外細(xì)胞相容性和細(xì)胞遷移。A）L929細(xì)胞B）HUVECs孵育1、3、5天后的細(xì)胞存活率。D）孵育24小時(shí)后L929細(xì)胞的活/死染色。E）不同時(shí)間（0、12、24 h）的細(xì)胞遷移照片和C）相應(yīng)的定量數(shù)據(jù)

（5）抗氧化和抗炎能力

為了驗(yàn)證復(fù)合水凝膠在體內(nèi)的抗氧化能力，H₂O₂處理的L929細(xì)胞被用作氧化應(yīng)激模型。與正常組相比，對照組和LAMC組的OD值顯著降低，存活率分別為23.57%和31.58%，并且在熒光顯微鏡下觀察到更多的死亡細(xì)胞(圖5A)。在用H₂O₂刺激后，在對照組中觀察到細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高(圖5B)。相比之下，LAMC組顯示出較弱的熒光強(qiáng)度，LAMC/CD-C@M@P組的活性氧水平進(jìn)一步下降。為了評價(jià)復(fù)合水凝膠的抗炎活性，研究了它們在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)后對RAW264.7細(xì)胞的M1/M2表型相關(guān)基因表達(dá)的影響。在LPS刺激后，M1相關(guān)基因(IL1β、iNOS和TNF-α)急劇增加(圖5D–F)。在LAMC組，IL-1β和TNF-α的表達(dá)略有抑制，而iNOS的表達(dá)略有增加。重要的是，LAMC/CD-C@M@P組顯著抑制了炎癥狀態(tài)下IL-1β、iNOS和TNF-α的表達(dá)。對于M2相關(guān)基因(Arg-1、TGF-β和IL-10)，與LPS和LAMC組相比，LAMC/CD-C@M@P組增加了這些基因的表達(dá)，如圖5G-I所示。在LAMC組中，觀察到輕微程度的分化，定量熒光強(qiáng)度是正常組的1.55±0.23倍。值得注意的是，LAMC/CD-C@M@P組表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)分化，定量熒光強(qiáng)度達(dá)到正常組的4.98±0.27倍(圖5J)。

圖6.復(fù)合水凝膠的抗氧化和抗炎作用。A）H2O2處理的L929細(xì)胞的細(xì)胞存活率。B）H2O2處理后L929細(xì)胞內(nèi)ROS水平。C）細(xì)胞內(nèi)ROS水平的熒光強(qiáng)度。D）白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、E）誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、F）TNF-α、G）人精氨酸酶-1（Arg-1）、H）轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和I）白細(xì)胞介素-10（IL-10）的相關(guān)基因表達(dá)。K）第7天PC12細(xì)胞的免疫染色圖像。J）β3-微管蛋白的熒光強(qiáng)度

（6）體內(nèi)pH監(jiān)測和傷口愈合

通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立SD大鼠糖尿病模型。該研究的進(jìn)展詳見圖6A。在血糖水平高于16.7 mM達(dá)7天后，將大鼠隨機(jī)分為對照組、LAMC組和LAMC/CD-C@M@P組。在感染初期，傷口的pH 值從酸性逐漸升高到堿性，提示細(xì)菌感染的發(fā)生。通過近紅外光照射，水凝膠的光熱治療功能激活，降低了傷口的 pH值并消除了感染。實(shí)驗(yàn)顯示，水凝膠不僅能夠有效實(shí)時(shí)監(jiān)測傷口的pH，還能通過光熱效應(yīng)殺滅細(xì)菌。此外，水凝膠在14天的傷口愈合過程中表現(xiàn)出優(yōu)異的促進(jìn)效果。與對照組和單純LAMC組相比，LAMC/CD-C@M@P組的傷口愈合速度更快，愈合率達(dá)到94.73%。這些結(jié)果表明，LAMC/CD-C@M@P水凝膠能夠顯著加快糖尿病傷口的愈合，減小感染的風(fēng)險(xiǎn)，并促進(jìn)整體傷口修復(fù)過程。

圖7.水凝膠在糖尿病傷口中的體內(nèi)研究。A）治療大鼠糖尿病傷口的實(shí)驗(yàn)程序。B）糖尿病傷口的建立、監(jiān)測和治療的示意圖。C）不同時(shí)期傷口的代表性照片。D）體內(nèi)pH監(jiān)測。E）第3天各組的細(xì)菌存活率。F）不同時(shí)期不同組的傷口愈合率。G）不同組的傷口愈合過程示意圖

（7）組織學(xué)和免疫熒光分析

通過免疫熒光染色和組織學(xué)分析評估LAMC/CD-C@M@P水凝膠的組織再生能力。蘇木精-伊紅(H&E)染色證明，LAMC/CD-C@M@P組在第14天后顯示最小的傷口長度(959.33±13.05微米)，并且顯示更少的炎性細(xì)胞以及更高程度的傷口閉合(圖7A，C)。圖7B顯示了Masson染色的結(jié)果，顯示與其他組相比，LAMC/CD-C@M@P組中膠原沉積的藍(lán)色增加且加深。數(shù)據(jù)的定量分析進(jìn)一步表明，LAMC/CD-C@M@P組的膠原沉積率(60.14±2.18%)高于對照組(27.24±2.41%)和LAMC組(43.88±4.35%)。進(jìn)行白細(xì)胞介素-6 (IL-6)和CD31的免疫熒光試驗(yàn)，以評估第7天的皮膚傷口修復(fù)。如圖8A、E所示，與對照組和LAMC組相比，LAMC/CD-C@M@P組表現(xiàn)出最低的IL-6表達(dá)，表明炎癥反應(yīng)減少。此外，圖8B、F顯示了LAMC中CD31的高表達(dá)/CD-C@M@P組，提示促進(jìn)新血管形成。隨后，在第14天對CD86和CD206表達(dá)的評估顯示，LAMC中M1相關(guān)生物標(biāo)志物減少，M2相關(guān)生物標(biāo)志物質(zhì)增加/CD-C@M@P組與其他組相比，表明LAMC/CD-C@M@P水凝膠可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2的分化，并表現(xiàn)出抗炎作用。為了評估神經(jīng)發(fā)生和血管生成，在第14天進(jìn)行了CD31和β3tubulin的免疫熒光染色(圖8D，I，J)。CD31的表達(dá)出現(xiàn)在對照組和LAMC組，表明有一定的血管生成，幾乎沒有觀察到β3-tubulin.的表達(dá)在LAMC/CD-C@M@P組中，CD31和β3-tubulin的熒光強(qiáng)度最明顯，表明可觀察到神經(jīng)和血管的整合再生。

圖8.傷口組織的組織學(xué)分析A）H&E染色和B）Masson染色在第14天的顯微照片。C）傷口長度和D）膠原沉積的統(tǒng)計(jì)分析

圖9.A）IL-6、B）CD31在不同組織創(chuàng)面中第七天的免疫熒光染色結(jié)果。C）巨噬細(xì)胞、D）CD31和β3-微管蛋白在不同創(chuàng)面組織中第14天的免疫熒光染色結(jié)果。E）IL-6、F）CD31、G）CD86、H）CD206、I）CD31和J）β3-微管蛋白在第14天的熒光強(qiáng)度

研究小結(jié)：

該研究提出了一種具有pH監(jiān)測、光熱抗菌、抗氧化和抗炎性能的新型診斷和治療水凝膠。在殼聚糖基水凝膠中摻入CDs使其具有光致發(fā)光，其熒光強(qiáng)度隨pH值的變化而變化。這一特性使水凝膠可以作為pH傳感器，通過熒光信號精準(zhǔn)地檢測傷口的pH值，為評估傷口狀態(tài)提供了一種方法。LAMC/CD-C@M@P水凝膠在體外表現(xiàn)出良好的機(jī)械性能、光熱轉(zhuǎn)換能力和近紅外下對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性能。此外，復(fù)合水凝膠還能有效緩解氧化應(yīng)激，減輕炎癥反應(yīng)，改善糖尿病創(chuàng)面微環(huán)境，促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合。因此，該研究為糖尿病創(chuàng)面提供了一種新的診療一體化治療策略。