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牙周炎是全球最普遍和最普遍的疾病之一，占成年人的發(fā)病率為 30%，嚴(yán)重?fù)p害患者的咀嚼能力，甚至對(duì)患者的自尊和社會(huì)或職業(yè)功能造成負(fù)面影響。牙周炎是由牙菌斑中的微生物侵入引發(fā)的，可逐漸破壞牙齒的支撐組織，通常會(huì)導(dǎo)致牙周袋的形成、牙槽骨的吸收，并最終導(dǎo)致牙齒脫落。目前，牙周炎治療的臨床治療主要集中在預(yù)防疾病進(jìn)展，包括機(jī)械療法、使用抗生素對(duì)抗生物膜以及服用抗炎藥。其受到根除深牙周袋細(xì)菌效率低、半衰期短的臨時(shí)刺激和副作用的限制。更重要的是，這些策略無法解決牙周炎不可逆的牙槽骨吸收問題。牙槽骨的吸收加劇了牙齒松動(dòng)，并產(chǎn)生了繼發(fā)性咬合創(chuàng)傷，從而影響患者的咀嚼功能，導(dǎo)致牙周炎的高度復(fù)發(fā)。因此，在牙周炎的預(yù)防和治療中非常需要抑制牙槽骨吸收和促進(jìn)骨再生，這仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。

針對(duì)上述問題，來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院馮祖建、王偉偉和天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院鄧嘉胤團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種仿生糖肽水凝膠（MH/GRW凝膠），該水凝膠通過精準(zhǔn)調(diào)節(jié)牙周炎治療中的破骨細(xì)胞和成骨作用，實(shí)現(xiàn)了骨骼穩(wěn)態(tài)的重建。這一創(chuàng)新成果為牙周炎的治療提供了新的策略，有望在臨床應(yīng)用中取得顯著療效。該文章以“Bioinspired Glycopeptide Hydrogel Reestablishing Bone Homeostasis through Mediating Osteoclasts and Osteogenesis in Periodontitis Treatment”為題于2024年10月14日發(fā)表在《ACS Nano》上（DOI：10.1021/acsnano.4c05677）。

方案. 仿生 MH/GRW 凝膠示意圖，具有持續(xù)的抗菌活性，能夠恢復(fù)牙周炎的骨穩(wěn)態(tài)

（1） GRW凝膠的制備與表征

葡甘露聚糖（GM）是一種多糖，具有生物相容性好、固有生物活性和易于功能化等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物遞送、組織工程和傷口愈合等領(lǐng)域。通過高碘酸鈉氧化GM并結(jié)合賴氨酸修飾的RADA肽，成功制備出RADA偶聯(lián)的GM水凝膠（GRWgel）。該水凝膠具有β-片層結(jié)構(gòu)的納米纖維微結(jié)構(gòu)，由RADA自組裝形成，且內(nèi)部多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互連通，RADA 肽的圓二色（CD）光譜在 220.5nm 處有最大橢圓率，在 202.5nm 處有最小值，這歸因于其特征性的 β - 折疊結(jié)構(gòu)，RADA 和 W9 混合溶液的 CD 光譜與 RADA 肽相似，表明添加 W9 沒有改變 RADA 固有的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（圖1a-c）。流變學(xué)測(cè)試表明，GM-RADA水凝膠（GRWgel）處于類固體狀態(tài)，具有可調(diào)節(jié)的機(jī)械性能(圖1d)。此外，GRWgel展現(xiàn)出優(yōu)異的自愈合能力，能夠在剪切力下保持結(jié)構(gòu)完整性(圖1e, f)。體外降解實(shí)驗(yàn)顯示，GRWgel在人工唾液中可持續(xù)降解（圖1g）。綜上所述，GRWgel作為一種新型水凝膠，具有納米纖維微結(jié)構(gòu)、可調(diào)節(jié)機(jī)械性能、良好注射性、自愈合能力和生物降解性等優(yōu)點(diǎn)，為藥物遞送和組織工程提供了潛在支架，具有廣闊的應(yīng)用前景。

圖1. GRW凝膠的制備和理化性質(zhì).（a） 不同樣品的代表性 TEM 圖像。比例尺，100 nm。（b） RADA、W9 和 RADA/W9 溶液的 CD 譜圖 （0.1 mg/mL）。（c） 凍干 RADA 和 GRW 凝膠的代表性 SEM 圖像.比例尺，100 μm。（d） GRW凝膠的流變分析在 0.1 至 100 rad/s 的頻率掃描下具有不同的 GM-CHO 含量 （GM-CHO：RADA/W9 = w：w）。（e） GRW凝膠的應(yīng)變掃描在 37 °C 時(shí)具有不同的 GM-CHO 含量。（f） GRW凝膠的自修復(fù)特性。（g） GRW凝膠的降解體外 （n = 3）

（2）MH/GRWgel的細(xì)胞相容性

本研究采用人牙齦上皮細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為模型細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。活/死染色結(jié)果顯示，大部分細(xì)胞在培養(yǎng)3天后存活（圖2a）。CCK8試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，這些細(xì)胞在肽和納米纖維水凝膠中的活性高于對(duì)照組，表明其有利于細(xì)胞增殖（圖2b-d）。Transwell試驗(yàn)顯示，RADA組和W9組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng)，而GRWgel組遷移的細(xì)胞數(shù)量最多，這可能歸因于糖肽聚合物的存在，為細(xì)胞粘附、通訊和遷移提供了合適的微環(huán)境（圖2e）。

圖2.GRW凝膠表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性并增強(qiáng) BMSCs 的遷移。（a） 孵育 3 天后 L929 、 HGEC 和 BMSCs 的活/死染色。比例尺，100 μm。（B-D）不同處理后 CCK-8 測(cè)定測(cè)定 L929 、 HGEC 和 BMSCs 的增殖能力 （n = 3）。（e） BMSCs 遷移測(cè)定和遷移細(xì)胞數(shù)定量分析 （n = 3） 的代表性圖像

（3）GRWgel抑制破骨細(xì)胞形成

破骨細(xì)胞是在生長和重塑過程中侵蝕骨骼的特殊細(xì)胞，是源自單核-巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞的多核細(xì)胞。RANKL 是一種信號(hào)因子，對(duì)破骨細(xì)胞生成至關(guān)重要且必要，并參與骨吸收。將高RANKL親和力的W9肽引入GM-RADA水凝膠（GRWgel），旨在干擾破骨細(xì)胞形成中RANKL與RANK的結(jié)合，抑制牙周炎骨吸收。通過TRAP染色評(píng)估，發(fā)現(xiàn)W9能顯著減少RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞成熟數(shù)量（圖3a）。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，W9下調(diào)了破骨細(xì)胞成熟相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和NFATc1的表達(dá)（圖3b），以及破骨細(xì)胞特異性功能分子如MMP9、TRAP和CTSK的編碼基因和蛋白表達(dá)（圖3c,d）。這些結(jié)果表明W9通過阻斷RANKL和RANK結(jié)合的下游通路來抑制破骨細(xì)胞成熟。分子對(duì)接模擬和ITC實(shí)驗(yàn)證實(shí)，W9與RANKL具有高結(jié)合親和力，通過多個(gè)氫鍵穩(wěn)定結(jié)合，W9 與 RANKL 結(jié)合以屏蔽 RANKL/RANK 交互，而不是直接與此交互競(jìng)爭(zhēng)。（圖3e-f），并干擾RANK細(xì)胞外域C端部分的結(jié)合，特別是CRD3環(huán)區(qū)域，從而屏蔽RANKL/RANK相互作用。在有無W9的情況下，RANKL和RANK的結(jié)合常數(shù)差異顯著，進(jìn)一步支持W9干擾RANKL和RANK結(jié)合并影響下游信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)論。因此，將W9引入GR水凝膠中顯示出對(duì)RANKL的特異性結(jié)合親和力，有效抑制破骨細(xì)胞成熟，為牙周炎等骨骼相關(guān)疾病的治療提供了新策略。

圖3.GRW凝膠通過與 RANKL 的特異性結(jié)合在體外抑制破骨細(xì)胞形成。（a） TRAP 陽性多核破骨細(xì)胞的圖像（破骨細(xì)胞：紅色箭頭）。比例尺，200 μm。（b） Western blot 破骨細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá) （n = 3）。（c） qPCR 破骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá) （n = 3）。（d） 不同樣品的 TRAP 活性 （n = 3）。（e） GRW凝膠和RANKL的結(jié)合通過分子剛性對(duì)接。（f） GRW凝膠和 RANKL之間的親和力 由 ITC 分析

（4）GRWgel誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化

破骨細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的骨吸收和成骨細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的骨形成之間的平衡被破壞會(huì)促進(jìn)牙槽骨丟失。除了抑制破骨細(xì)胞的形成外，成骨干預(yù)被認(rèn)為是促進(jìn)牙槽骨修復(fù)所必需的。成骨細(xì)胞源自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分化，對(duì)骨再生起關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，GRWgel因其糖肽成分及纖維狀多孔結(jié)構(gòu)，能促進(jìn)BMSCs粘附和伸展（圖4a）。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，GRWgel組在堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅S（ARS）染色中展現(xiàn)出最高的成骨效率和密集的鈣結(jié)節(jié)分布，表明其增強(qiáng)了成骨作用（圖4b, c）。此外，W9肽也被報(bào)道具有潛在成骨活性，可通過激活特定信號(hào)通路增加RUNX2表達(dá)水平。為進(jìn)一步評(píng)估GRWgel對(duì)BMSCs成骨分化的影響，通過qPCR和Western blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，GRWgel組顯著上調(diào)了BMP2、RUNX2、ALP和COL-I的表達(dá)（圖4d, e），表明GRWgel能增強(qiáng)BMSCs的粘附、增殖和成骨分化，有利于牙周炎治療中的骨再生。

圖4. GRW凝膠支持有效的細(xì)胞粘附和增強(qiáng)的體外成骨。（a） 培養(yǎng) 24 小時(shí)的 BMSCs 的形態(tài)。（b） 第 7 天捕獲的 ALP 染色圖像。（c） 骨誘導(dǎo) 21 天后的 ARS 染色。（d） 第 7 天 qPCR 測(cè)定的成骨相關(guān)基因表達(dá) （n = 3）。（e） 第 7 天 BMP2 和 RUNX2 的蛋白質(zhì)印跡分析和定量數(shù)據(jù) （n = 3）

（5）MH/GRWgel的抗菌活性

生物膜形成是牙周炎的引發(fā)因素，包括各種細(xì)菌菌落的侵襲和增殖。為了賦予GRW凝膠長期的抗菌性能，研究者將臨床上用作抗菌劑的MH物質(zhì)封裝在凝膠中（圖5a, b）。實(shí)驗(yàn)顯示，MH從GRW凝膠中持續(xù)釋放，有效延長了其在牙周組織的半衰期。通過菌落計(jì)數(shù)和死活染色等方法評(píng)估，MH/GRW凝膠對(duì)血鏈球菌、具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌等關(guān)鍵牙周致病菌表現(xiàn)出顯著的抗菌活性（圖5c）。特別是，該凝膠不僅能消除浮游狀態(tài)的細(xì)菌，還能有效去除生物膜內(nèi)的細(xì)菌。這歸因于MH的釋放和GRW凝膠中RADA肽的精氨酸殘基的原位抗菌作用，后者能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，使MH更易滲透到細(xì)菌內(nèi)部（圖5d, e）。因此，MH/GRW凝膠通過結(jié)合這兩種機(jī)制，顯示出強(qiáng)大的抗菌功效，有望成為牙周炎治療中消除細(xì)菌感染的有效手段。

圖5. MH/GRW凝膠顯示出有效的抗菌活性和去除生物膜的能力。（a）水凝膠及其抗菌特性的示意圖。（b）GRW凝膠的 MH累積釋放 (n = 3）。（c）血鏈球菌、核鐮刀菌和牙齦卟啉假單胞菌菌落的數(shù)量 （n = 3）。（d）MH/GRW 凝膠的長期抗菌作用體外 （n = 3）。（e）牙齦卟啉單胞菌的活/死染色。比例尺，100 μm。（f）牙齦卟啉單胞菌的 SEM 圖像。（g）牙齦卟啉單胞菌生物膜的活/死染色

圖6.MH/GRW凝膠在體內(nèi)顯示出抗菌活性和抑制牙槽骨吸收。（a） 結(jié)扎線誘導(dǎo)的牙周炎模型和治療過程的示意圖。（b） MH/GRW凝膠的抗菌效果治療 1 周后體內(nèi) （n = 5）。（c） 治療 4 周后 M2 周圍上頜牙槽骨的代表性 micro-CT 圖像。（d） M2 的 CEJ 和 ABC 之間距離的定量分析結(jié)果 （n = 5）。（例如）定量分析骨骼相關(guān)參數(shù)：顯微 CT 圖像中的 BV/TV （e）、Tb.Th （f） 和 Tb.Sp （g） （n = 5）

（6）MH/GRWgel在體內(nèi)促進(jìn)牙槽骨再生

為揭示牙槽骨形態(tài)，研究采用了H&E染色和馬松三色染色分析上頜樣本。結(jié)果顯示（圖7a），健康組牙槽骨吸收輕微，而對(duì)照組高度顯著降低，缺乏牙間乳頭，為牙周炎癥狀。相比之下，MH/GRW凝膠組牙槽骨高度較高，上皮組織正常，牙間乳頭特征明顯。馬松三色染色顯示（圖7b），MH/GRW凝膠治療后，再生牙槽骨多為成熟組織，膠原沉積有序且致密。免疫熒光染色（圖7c, d）和qPCR分析（圖7e）進(jìn)一步表明，MH/GRW凝膠組中RUNX2陽性細(xì)胞多，TRAP陽性細(xì)胞少，成骨基因表達(dá)高，破骨細(xì)胞基因表達(dá)低。這些結(jié)果表明，MH/GRW凝膠具有抗菌效果，能抑制破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨分化，有效抑制牙槽骨喪失，為牙周炎提供了一種有效的治療方法。

圖7.MH/GRW凝膠抑制牙槽骨吸收，促進(jìn)體內(nèi)牙槽骨再生。（a） 上頜標(biāo)本的 H&E 染色。比例尺，500 μm。黑色箭頭表示牙槽骨。紅色箭頭表示根。（b） 上頜牙槽骨的 Masson 三色染色。比例尺，500 μm。（c） RUNX2 （紅色） 免疫熒光染色和統(tǒng)計(jì)分析 （n = 3） 的代表性圖像。（d） TRAP IHC 和統(tǒng)計(jì)分析的代表性圖像 （n = 3）。（e） 牙槽骨中成骨 （ALP、RUNX2 和 CoL-I） 和破骨細(xì)胞 （TRAP） 基因表達(dá)的 qPCR 分析 （n = 3）

研究小結(jié)：

該研究制備了一種仿生糖肽水凝膠，將抗菌活性與抑制牙槽骨吸收和促進(jìn)牙槽骨再生協(xié)同結(jié)合以治療牙周炎。該凝膠具有制造簡(jiǎn)單、類似 ECM 的納米纖維和多孔微觀結(jié)構(gòu)、自修復(fù)能力和良好的注射性等優(yōu)點(diǎn)。MH 的原位釋放抑制了牙周袋中牙菌斑生物膜的形成，減輕了牙周炎。更重要的是，W9 的引入使水凝膠能夠特異性結(jié)合 RANKL 并抑制 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成。此外，W9 能夠促進(jìn) BMSCs 的成骨分化，增加 ALP 活性促進(jìn)成骨。因此，MH/GRW凝膠成功阻止大鼠牙周炎進(jìn)一步病變，抑制牙槽骨吸收，促進(jìn)牙槽骨再生。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了通過介導(dǎo)骨破骨細(xì)胞生成和成骨治療牙周炎重建骨穩(wěn)態(tài)的重要性，設(shè)想這種糖肽水凝膠具有巨大的潛力，可以成為臨床治療牙周炎的可行制劑。