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三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌亞型中預后最差的類型，面臨著高惡性度、復發(fā)和治療難度等問題。常用的化療藥物多柔比星（DOX）作為TNBC的一線治療方案，與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用顯示出更好的療效。這是因為DOX能夠誘導免疫原性細胞死亡，促進樹突狀細胞的成熟及細胞毒性T淋巴細胞的浸潤。然而，由于腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性和多種致癌信號的超激活，聯(lián)合療法往往面臨腫瘤耐藥和復發(fā)的挑戰(zhàn)。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）作為多條致癌信號通路的交匯點，與腫瘤免疫抑制微環(huán)境密切相關(guān)，因此針對STAT3的干預可能有助于逆轉(zhuǎn)TNBC的免疫抑制。盡管已有針對STAT3的抑制劑，但由于其水溶性和細胞滲透性差，臨床效果不佳。

針對上述問題，第三軍醫(yī)大學齊曉偉團隊采用小鼠三陰性乳腺癌細胞衍生的腫瘤外泌體（TEV）作為載體，開發(fā)了功能化的siSTAT3和多柔比星（DOX）聯(lián)合治療制劑（siSTAT3-DOX@TEV）。實驗結(jié)果表明，該制劑能夠精確靶向腫瘤組織，顯著下調(diào)STAT3表達，并有效誘導腫瘤免疫原性細胞死亡，逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境。此外，免疫組織化學和質(zhì)量細胞術(shù)分析顯示，在腫瘤組織中M1巨噬細胞及CD4+和CD8+ T細胞的水平顯著增加，表明該策略在臨床TNBC治療中的潛力。該文章于2024年10月30日以《Tumor-Derived Extracellular Vesicles Enable Tumor Tropism Chemo-Genetherapy for Local Immune Activation in Triple-Negative Breast Cancer》為題發(fā)表于《ACS Nano》（DOI：10.1021/acsnano.3c12967）。

siSTAT3-DOX@TEV制備及TNBC治療示意圖：siSTAT3-DOX@TEV有效誘導ICD逆轉(zhuǎn)免疫抑制的TME，從而介導強烈的抗腫瘤免疫反應

（1）siSTAT3-DOX@TEV的制備與表征

從4T1細胞培養(yǎng)上清液中收集腫瘤來源外泌體（TEVs），并通過透射電子顯微鏡（TEM）、西方印跡和納米顆粒跟蹤分析（NTA）進行表征。圖1A和B顯示，TEVs呈現(xiàn)典型的雙膜結(jié)構(gòu)和約95.6 ± 5.5 nm的直徑。WB結(jié)果（圖1C）表明TEVs中含有增加的外泌體蛋白標志物TSG101、CD63和Flotillin-1，表明外泌體分離成功。接著，通過商業(yè)試劑Exo-Fect轉(zhuǎn)染Cy5標記的siSTAT3（siSTAT3-cy5），圖1D顯示混合后，siSTAT3@TEV的熒光光譜與純siSTAT3-cy5相同，封裝效率約為70%（圖1E）。對siRNA完整性的檢測（圖1F）表明，TEVs能夠保護siRNA免受核酸酶的快速降解。隨后，采用共孵育法制備siSTAT3-DOX@TEV，將DOX加載到siSTAT3@TEV中。圖1H顯示，siSTAT3-DOX@TEV的紫外/可見光譜與純DOX相同，表明DOX被有效加載。對不同初始DOX輸入濃度的封裝效率計算（圖1I）顯示，從77.68%到93.36%不等。

圖1. siSTAT3-DOX@TEV 的表征。（A）TEV 的代表性 TEM。比例尺：200 nm。（B）通過 NTA 檢測到的 TEV 的粒度分布。（C）4T1 細胞裂解物和 TEV 的外泌體蛋白生物標志物（Flotillin-1、TSG101 和 CD63）表達的蛋白質(zhì)印跡分析。（D）siSTAT3 和 siSTAT3@TEV（siSTAT3-Cy5）的熒光光譜。（E）siSTAT3 的包封效率。（F）與 RNase A 孵育后裸露的 siSTAT3 和 siSTAT3@TEV 的瓊脂糖凝膠電泳。（G）具有梯度濃度的 DOX 的 UV/vis 光譜。（H）DOX 和 siSTAT3-DOX@TEV 的 UV/vis 光譜。（I）不同濃度點的 DOX 包封效率

（2）TEV介導的體內(nèi)外靶向效能

  為了評估TEVs作為藥物遞送載體的靶向腫瘤細胞的能力，研究將TEVs標記上熒光探針Dil，并與4T1細胞共同孵育。共聚焦顯微鏡顯示，4T1細胞有效內(nèi)化了TEVs（圖2A）。為探索TEVs在體內(nèi)的腫瘤靶向能力，研究將Dil標記的TEVs通過靜脈注射到原位4T1腫瘤小鼠模型中。治療后6、12、24和48小時收集腫瘤及主要器官，測量和定量熒光強度（圖2B、C）。在腫瘤組織中持續(xù)強烈的熒光信號表明，TEVs作為TNBC治療的遞送載體具有良好的腫瘤靶向能力。

圖2. TEVs 在體內(nèi)和體外的特定腫瘤趨向性行為。（A）在 37 ^oC 下用 PBS 和 TEVs 處理 4 小時的 4T1 細胞的共聚焦顯微鏡圖像。TEVs 用 Dil（紅色）標記，細胞骨架用 Actin-Tracker Green-488 染色。（B）PBS 或 TEV 靜脈注射后小鼠主要器官和腫瘤的熒光圖像。TEVs 用 Dil 標記。（C）腫瘤組織熒光強度的量化

（3）TEV的細胞攝取機制

  為了探索TEVs的細胞攝取途徑，研究對4T1細胞進行了內(nèi)吞抑制劑的預處理。結(jié)果顯示，氨氯地昂（Na+/H+泵相關(guān)微內(nèi)吞抑制劑）和M-β-CD（克拉勝內(nèi)吞抑制劑）并未阻礙TEVs的攝取（圖3A），而dynasore（動力蛋白依賴性內(nèi)吞抑制劑）顯著抑制了TEV的攝取。這表明TEVs主要通過動力蛋白依賴的途徑內(nèi)吞，而這種途徑被認為是外泌體攝取的主要方式。當siRNA進入細胞后，容易被大量溶酶體吞噬，使其難以順利轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。因此，能否在體內(nèi)逃脫溶酶體吞噬是遞送載體能否實現(xiàn)細胞內(nèi)輸送的關(guān)鍵。為了評估TEVs的溶酶體逃逸能力，研究將siSTAT3-Cy5加載到TEVs中，與細胞共同孵育后再用溶酶體追蹤劑染色。共聚焦顯微鏡觀察顯示，siSTAT3-Cy5在進入細胞后4小時內(nèi)完全被困在溶酶體中，但隨著時間的推移，siSTAT3-Cy5與溶酶體的重疊逐漸減少（圖3B）。這些結(jié)果表明，TEVs能夠成功逃脫溶酶體。

圖3. TEV 的細胞攝取機制和貨物轉(zhuǎn)運能力。（A）4 小時后 4T1 細胞中 TEV（Dil-TEV，紅色）的細胞攝取的共聚焦顯微鏡圖像（TEV 濃度：30 μg/mL）。細胞核用 DAPI（藍色）染色。（B）與 siSTAT3@TEV（Cy5，紅色）孵育的 4T1 細胞的共聚焦顯微鏡圖像。在 37 °C 下進一步孵育 4、6、12 和 24 小時后，用 LysoTracker（綠色）染色細胞

（4）體外協(xié)同化療-基因療法效果

  該研究將多柔比星（DOX）引入siSTAT3@TEV，以驗證其協(xié)同抗腫瘤效果。通過CCK-8檢測在48小時后的抗腫瘤增殖活性。所有組別均表現(xiàn)出劑量依賴性的細胞毒性，特別是協(xié)同治療的siSTAT3-DOX@TEV組顯示出最低的增殖活性（圖4A）。與對照組（PBS）相比，裸siSTAT3和siSTAT3@TEV組的細胞活力沒有顯著變化。DOX組和siSTAT3-DOX組的細胞增殖活性均有所降低，但協(xié)同治療組的殘存存活細胞僅為4.5%（圖4B）。細胞凋亡結(jié)果顯示，Control組、siSTAT3組、DOX組、siSTAT3@TEV組和siSTAT3-DOX組的凋亡率分別為21.73%、19.62%、29%、48.2%和43.2%，而siSTAT3-DOX@TEV組的凋亡率高達64.9%（圖4C、D）。這些結(jié)果表明，協(xié)同的siSTAT3-DOX@TEV組具有更好的抗腫瘤效率。

圖4. siSTAT3-DOX@TEV 體外協(xié)同治療。（A）用 DOX、siSTAT3-DOX 或 siSTAT3-DOX@TEV 處理 48 小時后的 4T1 細胞活力。（B）用對照、siSTAT3、siSTAT3@TEV、siSTAT3-DOX、DOX 或 siSTAT3-DOX@TEV 處理 48 小時后的 4T1 細胞活力。（C）用對照、siSTAT3、siSTAT3@TEV、siSTAT3-DOX、DOX 或 siSTAT3-DOX@TEV 處理 48 小時后，通過 AF647/7AAD 染色流式細胞術(shù)分析細胞凋亡率。（D）細胞凋亡率的量化

（5）協(xié)同化學基因治療促進體內(nèi) ICD

為探究siSTAT3-DOX@TEV協(xié)同治療在誘導腫瘤細胞免疫原性死亡（ICD）中的作用，研究采用免疫組化方法檢測腫瘤中CRT和HMGB1的表達。圖5A展示了治療方案。結(jié)果顯示，對照組、siSTAT3組和siSTAT3@TEV組的CRT和HMGB1表達較低。而在siSTAT3-DOX@TEV組中，CRT轉(zhuǎn)位至細胞膜和HMGB1的表達顯著增加，且與DOX組和siSTAT3-DOX組相比均有顯著差異（圖5B–D）。上述結(jié)果表明，siSTAT3-DOX@TEV協(xié)同治療增強了腫瘤細胞的免疫原性死亡。

圖5. siSTAT3-DOX@TEV 體內(nèi)協(xié)同治療。（A）指示治療方案，iv，靜脈注射。（B）腫瘤中 CRT 和 HMGB1 表達的免疫組織化學分析。在抗腫瘤研究結(jié)束時對腫瘤組織中 (C) CRT 和 (D) HMGB1 的陽性率進行免疫組織化學分析

（6）協(xié)同化療-基因療法抑制體內(nèi)TNBC生長

在腫瘤生長1周后，當腫瘤體積接近50 mm3時，通過尾靜脈注射對照組、siSTAT3組、DOX組、siSTAT3-DOX組、siSTAT3@TEV組或siSTAT3-DOX@TEV組。結(jié)果顯示，對照組和siSTAT3組之間的腫瘤體積幾乎沒有差異，而DOX組和siSTAT3-DOX組對腫瘤生長的抑制效果適中，但不足以顯著抑制。值得注意的是，siSTAT3@TEV組由于TEVs的腫瘤靶向能力，其抗腫瘤效果明顯強于單獨的siSTAT3。siSTAT3-DOX@TEV組顯示出最佳抗腫瘤效果，表明DOX和siRNA在體內(nèi)具有協(xié)同效應。這一結(jié)果通過腫瘤組織大小得到了驗證（圖6C–E），siSTAT3-DOX@TEV組的平均腫瘤重量僅為0.23 g（圖6D），顯著低于其他組。H&E染色結(jié)果顯示，siSTAT3-DOX@TEV組的腫瘤細胞最為稀疏（圖6F）。免疫組化分析表明，siSTAT3@TEV和siSTAT3-DOX@TEV組的STAT3表達水平顯著降低，且Ki67染色顯示siSTAT3-DOX@TEV組的細胞增殖率最低（圖6F）。Western blot結(jié)果進一步驗證了STAT3表達的顯著降低（D）。免疫組化分析顯示，CCL2和α-SMA在對照組和siSTAT3組中高度表達，而在siSTAT3-DOX@TEV組中表達減少最顯著（圖6G），表明siSTAT3-DOX@TEV在腫瘤微環(huán)境中減少了細胞外基質(zhì)的形成，增強了藥物的滲透效果并提高了抗腫瘤效果。

圖6. siSTAT3-DOX@TEV 體內(nèi)協(xié)同治療。（A）指示的治療方案，iv，靜脈注射。（B）治療后 4T1 荷瘤小鼠的體重。（C）治療后第 14 天的代表性腫瘤圖像和（D）切除的腫瘤重量。（E）治療期間 4T1 荷瘤小鼠的腫瘤生長曲線。（F）抗腫瘤研究結(jié)束時小鼠腫瘤組織的 H&E 和 Ki67 染色。（G）研究結(jié)束時腫瘤組織中 α-SMA 和 CCL2 表達水平的免疫組織化學分析

（7）siSTAT3-DOX@TEV的局部免疫激活作用

     通過對腫瘤免疫景觀的CyTOF分析（圖7A），進一步探討了siSTAT3-DOX@TEV治療對腫瘤微環(huán)境（TME）的影響。原位模型樣本經(jīng)分析后確定了26個細胞簇，利用42個免疫標記物進行標記（圖7B）。根據(jù)典型標記物識別了已知細胞類型（圖7C）。對腫瘤浸潤淋巴細胞的T細胞重新聚類分析顯示，siSTAT3-DOX@TEV組的CD4+ T細胞和CD8+ T細胞數(shù)量顯著增加（圖7D,E）?？傮w來說，免疫景觀分析表明，siSTAT3-DOX@TEV改變了免疫豁免的TME，使其向有利于免疫治療的TME轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為M2極化巨噬細胞減少、M1極化巨噬細胞、CD4+ T細胞和CD8+ T細胞數(shù)量增加，從而可能激活局部抗腫瘤免疫反應。為進一步驗證siSTAT3-DOX@TEV的協(xié)同免疫激活效果，通過免疫組化分析評估了治療后免疫細胞的變化。這些數(shù)據(jù)表明siSTAT3-DOX@TEV有效促進了免疫細胞浸潤，并產(chǎn)生了強烈的抗腫瘤免疫反應。

圖7. 治療后腫瘤浸潤免疫細胞的 CyTOF 分析。（A）CyTOF 分析示意圖。（B）免疫細胞中表達的標志物標準化表達熱圖。左側(cè)和右側(cè)分別顯示免疫細胞的類型和比例。（C）t-SNE 繪制了主要免疫細胞類型的標志物顏色編碼表達。（D）t-SNE 繪制了 CD4 + T 細胞和 CD8 + T 細胞的標志物顏色編碼表達。主要免疫細胞類型用紅色框標記。（E）免疫細胞亞群的頻率圖

（8）生物相容性評估

為驗證該共遞送體系的生物相容性，該研究進行了溶血實驗，以評估TEV的溶血活性。結(jié)果顯示，TEV在1–5 mg/mL濃度范圍內(nèi)的溶血率均低于5%（圖8A，B），滿足靜脈注射藥物遞送的安全性要求。此外，為進一步評估siSTAT3-DOX@TEV的生物相容性，在體內(nèi)實驗結(jié)束后取出主要器官（心臟、肝臟、脾臟、肺和腎臟）進行H&E染色。結(jié)果顯示，這些器官均未出現(xiàn)顯著的組織病理學變化（圖8C）。這些結(jié)果表明，siSTAT3-DOX@TEV具有良好的生物相容性。

圖8. siSTAT3-DOX@TEV 生物相容性概況。（A）與 siSTAT3-DOX@TEV 一起孵育的紅細胞圖像。（B）與 siSTAT3-DOX@TEV 一起孵育的紅細胞溶血率。（C）抗腫瘤研究結(jié)束時主要器官的 H&E 染色

研究小結(jié)：

綜上所述，該研究提出并優(yōu)化了一種基于TEV共載siSTAT3和DOX的腫瘤趨向性協(xié)同化療-基因治療策略。通過CyTOF和免疫組化分析揭示了其協(xié)同抗腫瘤免疫效應。該策略顯著下調(diào)了腫瘤內(nèi)部的STAT3表達，增強了DOX誘導的腫瘤免疫原性細胞死亡（ICD），消除了腫瘤周圍的物理屏障，促進了免疫細胞的充分浸潤，激活了抗腫瘤免疫反應，并實現(xiàn)了有效的腫瘤消退。該策略為精準治療高度異質(zhì)性的TNBC提供了一種有效的化療-基因治療方法，并可推廣至其他類型的腫瘤。