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    骨軟骨是一種具有多層級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織，包括關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨。具體來說，骨軟骨組織自表面到底部可以分為表層軟骨、彈性軟骨和纖維軟骨區(qū)。在這些不同的區(qū)域中，細(xì)胞外基質(zhì)的組成、膠原纖維的排列方向以及組織的機(jī)械性能均呈現(xiàn)梯度變化。例如，羥基磷灰石（HAP）的含量沿梯度分布，關(guān)節(jié)表面的透明軟骨幾乎不含 HAP，而在彈性軟骨和纖維軟骨中其含量逐漸增多。隨著骨軟骨區(qū)域礦物含量的增加，其機(jī)械性能也相應(yīng)增強(qiáng)。當(dāng)前，骨軟骨缺損修復(fù)的主要挑戰(zhàn)在于如何模擬骨軟骨區(qū)域的梯度結(jié)構(gòu)，以實(shí)現(xiàn)理想的修復(fù)效果。

針對(duì)上述問題，浙江大學(xué)唐?？到淌趫F(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，通過重力滲透法可以制備具有連續(xù)梯度結(jié)構(gòu)的礦化水凝膠，用于骨軟骨缺損的修復(fù)。該方法利用聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDMA）和透明質(zhì)酸（HA）作為有機(jī)支架，構(gòu)建了具有連續(xù)梯度礦物分布的水凝膠。PEGDMA是一種常見的水凝膠材料，因其優(yōu)良的生物相容性和吸水能力廣泛應(yīng)用于組織工程和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；此外，PEGDMA富含潛在活性官能團(tuán)，能夠?yàn)樗z提供理想的材料硬度，從而滿足組織修復(fù)對(duì)力學(xué)性能的需求。透明質(zhì)酸作為人體軟骨和滑液中的天然成分，兼具良好的生物相容性，可補(bǔ)充軟骨細(xì)胞外基質(zhì)并為關(guān)節(jié)提供潤滑和緩沖功能。其抗氧化特性還能中和自由基，降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損害。在此研究中，通過引入光敏劑成功建立了HA/PEGDMA交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。隨后，重力滲透法引入約2 nm的磷酸鈣前驅(qū)體，使水凝膠呈現(xiàn)連續(xù)梯度的礦物含量和力學(xué)性能。這種基于重力滲透制備的礦化水凝膠材料，憑借其獨(dú)特的連續(xù)梯度結(jié)構(gòu)，為骨軟骨缺損修復(fù)提供了新的有效途徑。該文章于2024年09月02日以《Continuous-Gradient Mineralized Hydrogel Synthesized via Gravitational Osmosis for Osteochondral Defect Repair》為題發(fā)表于《Advanced Functional Materials》（DOI: 10.1002/adfm.202408249）。

連續(xù)梯度礦化水凝膠的制備與應(yīng)用示意圖

（1）連續(xù)梯度礦化水凝膠的制備與表征以及HAP 物理性質(zhì)和比例

在紫外光照射下形成了PEGDMA/HA交聯(lián)水凝膠（簡稱pH水凝膠），作為有機(jī)框架，隨后用于制備連續(xù)梯度礦化水凝膠。通過重力滲透法，在pH水凝膠中逐步引入不同濃度的約2 nm ACPC液滴，從而形成了連續(xù)梯度結(jié)構(gòu)的pH@ACPC和pH@simi-ACPC水凝膠（圖1a）。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，結(jié)晶HAP呈納米棒狀，長度約為100 nm（圖1b）。pH@ACPC水凝膠的TEM圖像展示了納米棒狀HAP晶體與不規(guī)則形狀的有機(jī)成分，顯示出ACPC在水凝膠內(nèi)結(jié)晶為HAP的過程（圖1d）。掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)一步確認(rèn)了pH@ACPC水凝膠的表面結(jié)構(gòu)，顯示出水凝膠內(nèi)頂部、中部和底部的三個(gè)界面區(qū)域：頂部的HAP晶體濃度較高，中間部分的濃度稍低，而底部幾乎無HAP顆粒（圖1e）。對(duì)pH@ACPC水凝膠中部區(qū)域進(jìn)行的能量色散光譜（EDS）元素映射顯示，C、O、Ca和P元素均勻分布，表明復(fù)合水凝膠制備的一致性良好（圖1f）。利用微型計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT）圖像及其重建結(jié)果進(jìn)一步表征水凝膠內(nèi)HAP晶體的分布，驗(yàn)證了HAP在水凝膠中的連續(xù)梯度分布（圖1g）。結(jié)果顯示，在水凝膠底層約500μm厚度區(qū)域內(nèi)無HAP分布，接近兔軟骨的平均厚度。含有HAP的水凝膠表現(xiàn)出典型的黏彈性能，儲(chǔ)能模量（G'）在整個(gè)頻率范圍內(nèi)均高于損耗模量（G''）（圖1j）。通過這種方法制備的礦化水凝膠表層的壓縮模量為636 KPa，底層為1000 KPa，符合骨軟骨部位的生物力學(xué)特性（圖1m）。

圖1 連續(xù)梯度礦化水凝膠的制備和表征。a）連續(xù)梯度礦化水凝膠的主要合成過程。B）完全礦化的HAP的TEM圖像，顯示納米棒狀HAP納米顆粒。c）pH@ACP水凝膠的TEM圖像，顯示納米棒狀HAP納米顆粒和有機(jī)組分。d）HAP的HR-TEM圖像，顯示HAP的晶格條紋。pH@ACPC水凝膠的SEM圖像(e)和相應(yīng)的EDS元素圖譜(f)。g)pH @ ACPC水凝膠的CT圖像，表明水凝膠中HAP的連續(xù)梯度分布。HAP和pH@ACPC水凝膠的XRD光譜。HAP、pH和pH@ACPC水凝膠的ATR-FTIR圖譜。j–l)pH @ ACPC水凝膠的流變性質(zhì)顯示j)頻率依賴性，k)應(yīng)變依賴性，l)階躍應(yīng)變振蕩剪切流變。m) pH@ACPC 水凝膠上部、中部和下部的壓縮測試，顯示 pH@ACPC 水凝膠內(nèi)機(jī)械性能的梯度分布

（2）連續(xù)梯度礦化水凝膠誘導(dǎo) MSCs 體外成骨分化

     與對(duì)照組相比，pH@semi-ACPC組和pH@ACPC組的堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)分別顯著上調(diào)了2.32倍和2.55倍（圖2a）。在pH@semi-ACPC和pH@ACPC水凝膠中，COL1A1的表達(dá)均顯著提高（圖2b）。如圖2c所示，pH@ACPC組的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）表達(dá)量最高。骨橋蛋白（OPN）能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的遷移、粘附和成熟，調(diào)節(jié)其與其他細(xì)胞的相互作用，主要影響骨基質(zhì)的形成和礦化。在水凝膠處理組中，與對(duì)照組相比，HAP的存在顯著上調(diào)了OPN的表達(dá)（圖2d）。使用兩種類型HAP負(fù)載的水凝膠培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）后，通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察到更強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)，表明兩組中COL1A1蛋白表達(dá)增加（圖2e）。此外，通過吸光度測量對(duì)ALP活性進(jìn)行定量評(píng)估，間接反映了不同處理組的整體ALP活性，與RT-qPCR結(jié)果一致（圖2h）。茜素紅S（ARS）染色用于可視化和識(shí)別鈣結(jié)節(jié)，其結(jié)果顯示為紅色沉積。結(jié)果表明，用兩種連續(xù)梯度礦化水凝膠誘導(dǎo)MSCs兩周后，細(xì)胞外基質(zhì)中鈣結(jié)節(jié)數(shù)量顯著增加（圖2i）。同時(shí)，通過溶解紅色礦化沉積物的測定，兩個(gè)連續(xù)梯度礦化組在405 nm的光學(xué)密度（OD）值更高（圖2j）。

圖2 連續(xù)梯度礦化水凝膠培養(yǎng)的 MSCs 的成骨分化。成骨培養(yǎng) 7 天后骨相關(guān)基因 ALP a)、COL1A1 b)、BMP2 c)、OCN d) 的 RT-qPCR 定量分析。e)不同水凝膠培養(yǎng)14天MSCs的細(xì)胞免疫熒光圖像，顯示COL1A1蛋白的表達(dá)。f)不同水凝膠誘導(dǎo)14天后MSCs成骨分化相關(guān)蛋白的WB結(jié)果。對(duì)照，pH、pH@semi-ACPC和pH@ACPC組孵育7天后ALP染色g)和定量統(tǒng)計(jì)h)。ARS染色I(xiàn))和在405 nm處檢測到的相關(guān)染色強(qiáng)度j)用于評(píng)估培養(yǎng)14天后對(duì)照組、pH組、pH @半ACPC組和pH@ACPC組中MSCs形成的鈣沉積

（3）pH水凝膠能夠在受損環(huán)境中通過抵抗活性氧（ROS）來保護(hù)軟骨細(xì)胞的合成代謝表型

阿爾新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色反映了軟骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的積累。此外，過氧化氫（H2O2）可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激環(huán)境。染色結(jié)果表明，在存在ROS的情況下，pH組的軟骨細(xì)胞的合成代謝能力基本得以保留（圖3a，b）。聚集蛋白聚糖 (ACAN) 和 II 型膠原蛋白 (COL2) 是評(píng)估軟骨細(xì)胞合成代謝最常用的生物標(biāo)志物。RT-qPCR 分析的結(jié)果與染色的結(jié)果一致，表明暴露于 H₂O₂ 的軟骨細(xì)胞中的 ACAN 和 COL2 的表達(dá)也可以通過純 pH 水凝膠保留 (圖 3c、d)。pH 水凝膠對(duì)軟骨細(xì)胞合成代謝的保護(hù)作用可能通過減少 ROS 和炎癥因子發(fā)揮。使用 ROS 熒光探針檢測軟骨細(xì)胞中的 ROS 水平。熒光信號(hào)強(qiáng)度表明，與僅受H₂O₂刺激的陽性對(duì)照組相比，兩種 pH 水凝膠濃度組均能夠降低 ROS 水平（圖 3e）。使用流式細(xì)胞術(shù)定量分析細(xì)胞的熒光信號(hào)，發(fā)現(xiàn)水凝膠處理組和陽性對(duì)照組之間存在顯著差異（圖 3f、g）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在 pH 水凝膠存在下，過氧化氫誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡顯著減少（圖 3h、i）。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明，使用濃度為 100 或 200 μg mL?1 的 pH 水凝膠可顯著降低軟骨細(xì)胞中的 TNF-α 表達(dá)（圖 3j）。

圖3 pH水凝膠對(duì)氧化應(yīng)激下軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。a、b)微團(tuán)培養(yǎng)軟骨細(xì)胞經(jīng)阿爾新藍(lán)和甲苯胺藍(lán)染色，顯示其具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力。c、d)軟骨細(xì)胞中合成代謝基因的RT-qPCR分析。e) 兩種pH濃度下陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、干預(yù)組軟骨細(xì)胞ROS熒光圖像。f) 不同處理下軟骨細(xì)胞ROS流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。g)流式細(xì)胞術(shù)后定量測定四組ROS陽性軟骨細(xì)胞的比例。h) 使用熒光染色的流式細(xì)胞術(shù)分析對(duì)凋亡的軟骨細(xì)胞進(jìn)行量化。i) 流式細(xì)胞術(shù)檢測到的凋亡軟骨細(xì)胞百分比，包括早期和晚期凋亡細(xì)胞。j) 軟骨細(xì)胞 TNF-α表達(dá)的細(xì)胞免疫熒光圖像

（4）連續(xù)梯度礦化水凝膠誘導(dǎo)體內(nèi)骨軟骨再生

使用micro-CT分析評(píng)估缺損區(qū)域的新骨形成情況。結(jié)果顯示，6周后，對(duì)照組和pH組中僅有少量新骨組織生成；相比之下，pH@full-ACPC和pH@ACPC組出現(xiàn)顯著的軟骨下骨重建（圖4a）。在水凝膠植入12周后，各組的修復(fù)程度有所差異，但pH@semiACPC、pH@full-ACPC和pH@ACPC組中再生骨的數(shù)量顯著增加，表明這三種水凝膠具有較強(qiáng)的骨修復(fù)能力。通過骨體積/組織體積（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數(shù)量（Tb.N）等關(guān)鍵指標(biāo)，定量評(píng)估新生骨的空間結(jié)構(gòu)和重建骨的質(zhì)量。結(jié)果證實(shí)，pH@full-ACPC和pH@ACPC組的新骨形成明顯優(yōu)于對(duì)照組和pH@semi-ACPC組（圖4b-g）。

采用蘇木精-伊紅（HE）染色評(píng)估再生組織的整體形態(tài)，以便觀察軟骨和軟骨下骨的再生情況（圖5a、f）。術(shù)后6周時(shí)，對(duì)照組和pH@semi-ACPC組僅顯示極少的新軟骨組織和軟骨下骨形成；相反，pH@ACPC組的骨軟骨缺損得到顯著修復(fù)，與micro-CT分析結(jié)果一致。12周后，與對(duì)照組相比，水凝膠治療組顯示出廣泛的骨組織修復(fù)。在關(guān)節(jié)軟骨形成方面，pH@ACPC組的新生軟骨結(jié)構(gòu)連續(xù)完整，而其他組則表現(xiàn)為不規(guī)則且不完整的軟骨層。pH@ACPC組表現(xiàn)出顯著的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)形成，反映了軟骨修復(fù)效果的優(yōu)勢。

此外，采用免疫熒光染色法檢測軟骨組織中ACAN（圖5d，i）和COL2（圖5e，j）的表達(dá)。作為關(guān)鍵的軟骨基質(zhì)分泌蛋白，這兩種標(biāo)志物的表達(dá)在軟骨形成中起到重要作用。植入水凝膠6周和12周后，水凝膠處理組中軟骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，其中pH@full-ACPC組的免疫熒光信號(hào)較pH@ACPC組略低?？傮w結(jié)果表明，連續(xù)梯度礦化水凝膠在骨軟骨缺損修復(fù)中顯示出顯著的效果，具備良好的臨床應(yīng)用前景。

圖4 軟骨下骨修復(fù)的Micro-CT圖像及定量統(tǒng)計(jì)。a）從上到下四列圖像分別為3D重建得到的micro-CT圖像、兩個(gè)角度的2D重建micro-CT圖像以及修復(fù)后的軟骨下骨組織的3D micro-CT重建。b–g）四組的BV/TV、Tb.Th和Tb.N表達(dá)，代表修復(fù)后的軟骨下骨組織的定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖5 不同組術(shù)后6周、12周再生組織的組織學(xué)和免疫熒光圖像。a、f) HE染色。b,g) 番紅-O/固綠染色。c,h) 甲苯胺藍(lán)染色。d,i) ACAN 的免疫熒光染色圖像。藍(lán)色熒光信號(hào)表示細(xì)胞核，而綠色熒光信號(hào)表示 ACAN。e,j) COL2 的免疫熒光染色圖像

研究小結(jié)：

該研究團(tuán)隊(duì)通過重力滲透法成功制備出具有連續(xù)梯度結(jié)構(gòu)的礦化水凝膠，使其在結(jié)構(gòu)上模擬了自然骨軟骨的復(fù)雜層次，同時(shí)在功能上實(shí)現(xiàn)了對(duì)骨軟骨缺損的精準(zhǔn)修復(fù)調(diào)控。該材料的設(shè)計(jì)充分考慮了骨軟骨單位的力學(xué)需求與生物學(xué)特性，使其在修復(fù)過程中能夠?yàn)檐浌菍雍蛙浌窍鹿菍犹峁┧璧奶囟ㄎh(huán)境。這一仿生材料設(shè)計(jì)不僅為骨軟骨缺損的修復(fù)提供了新的理論視角，也在實(shí)際應(yīng)用中為開發(fā)更高效的生物材料開辟了新的方向。通過精確調(diào)控材料的成分和結(jié)構(gòu)，這種材料能夠更好地模擬骨軟骨的自然特性，有望在未來的骨軟骨修復(fù)領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。