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急性肺損傷（ALI）及其更為嚴(yán)重的形式急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種與M1/M2巨噬細(xì)胞極化失衡密切相關(guān)的危及生命的疾病。現(xiàn)有治療策略因副作用、給藥途徑受限及靶向性差而存在諸多爭(zhēng)議，限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái)，草藥醫(yī)學(xué)的發(fā)展揭示了許多具有抗炎作用的化合物，這些化合物有望應(yīng)用于ALI的治療。其中，佛柑內(nèi)酯（bergapten）是一種從無(wú)花果屬（Ficus simplicissima Lour.）中分離出來(lái)的補(bǔ)骨脂素類(lèi)化合物，盡管它主要被用于抗癌治療，但其對(duì)ALI的潛在療效仍未被探索。由于bergapten的低溶解性和不良體內(nèi)分布，大大限制了其應(yīng)用潛力，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種能夠提高bergapten靶向性和療效的遞送系統(tǒng)，用于ALI的治療。

針對(duì)上述問(wèn)題，廣州中醫(yī)藥大學(xué)張忠德團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種具有生物活性且靶向肺部的脂質(zhì)納米藥物，命名為Ber-lipo，該納米藥物將bergapten與二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）脂質(zhì)體結(jié)合。DPPC是肺表面活性劑的主要成分，具有幫助藥物遞送至肺部的作用。Ber-lipo在體外和體內(nèi)均顯示出良好的穩(wěn)定性、生物分布和生物相容性，并顯著改善了小鼠ALI表型，包括肺水腫、促炎狀態(tài)、肺損傷、肺功能障礙和肺通透性。此外，Ber-lipo通過(guò)減少促炎的M1型巨噬細(xì)胞并增加抗炎的M2型巨噬細(xì)胞，維持了巨噬細(xì)胞極化的平衡。機(jī)制上，Ber-lipo抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活?？傊?，該研究首次證明了Ber-lipo通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，緩解ALI癥狀，為臨床ALI治療提供了一種有前景的策略。相關(guān)研究在2024年10月1日以“Inhalable and bioactive lipid-nanomedicine based on bergapten for targeted acute lung injury therapy via orchestrating macrophage polarization”為題發(fā)表于《Bioactive Materials》（DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.09.020）上。

圖1 開(kāi)發(fā)具有生物活性且具有肺靶向性的Ber-lipo，通過(guò)抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)維持巨噬細(xì)胞極化的穩(wěn)態(tài)，從而增強(qiáng)小鼠 ALI 治療

（1） Ber-lipo的合成及表征

本研究通過(guò)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Ber-lipo的物理化學(xué)性質(zhì)和治療效果。透射電子顯微鏡（圖2A）顯示，Lipo和Ber-lipo均呈均一球形，直徑約為115 nm，動(dòng)態(tài)光散射（圖2B）進(jìn)一步證實(shí)了Lipo和Ber-lipo的平均粒徑分別為111.2 nm和116.1 nm。電泳光散射（圖2C）顯示其zeta電位分別為-9 mV和-7 mV，表明bergapten與Lipo具有良好的電荷相容性。粒徑和多分散指數(shù)的7天監(jiān)測(cè)結(jié)果（圖2D-E）顯示其在水中保持良好穩(wěn)定性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，Dil標(biāo)記的Lipo在RAW264.7細(xì)胞中分布均勻，且LPS刺激無(wú)顯著影響（圖2F）。在急性肺損傷（ALI）小鼠模型中，IVIS成像（圖2G-K）表明，Dir標(biāo)記的Lipo在肺部的積累隨時(shí)間增加，且在血液中具有良好穩(wěn)定性（圖2L）。這些結(jié)果共同證明了Ber-lipo在ALI治療中的潛力。

圖2 Ber-lipo 的特性。（A）使用 TEM 可視化的 Lipo 和 Ber-lipo 的形態(tài)。（B）通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射法分析 Lipo 和 Ber-lipo 的尺寸分布。（C）通過(guò)電泳光散射法測(cè)試室溫下在水中稀釋的 Lipo 和 Ber-lipo 的表面 zeta 電位。（D）在水中儲(chǔ)存 7 天后 Lipo 和 Ber-lipo 的尺寸穩(wěn)定性。（E）連續(xù) 7 天內(nèi) Lipo 和 Ber-lipo 在水中的多分散指數(shù)。（F）用共聚焦顯微鏡成像的 Dil/Dil@lipo 在有或沒(méi)有 LPS 刺激的 RAW264.7 細(xì)胞中的生物分布。 (G) IVIS 下觀(guān)察到Dir/Dir@lipo 在 ALI 小鼠體內(nèi)的生物分布示意圖。 (H–L)：(H)通過(guò) IVIS 成像觀(guān)察腹膜內(nèi)注射 Dir@lipo 和 Dir 后不同時(shí)間段在主要器官中的體內(nèi)生物分布。 (I) 各組肺與肝熒光強(qiáng)度比的統(tǒng)計(jì)分析。 (J–L) 肝臟、肺和血液中熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析

(2) Ber-lipo的生物相容性與安全性評(píng)估

為評(píng)估Ber-lipo的體外生物相容性，使用了RAW264.7細(xì)胞和HUVECs，并通過(guò)CCK-8、活/死染色和細(xì)胞骨架染色檢測(cè)其毒性。結(jié)果顯示，在2.5?40 μM濃度下，bergapten和Ber-lipo的細(xì)胞活性與對(duì)照組相似，但80 μM濃度的bergapten導(dǎo)致24%的HUVECs死亡，而B(niǎo)er-lipo未表現(xiàn)出類(lèi)似毒性，表明Lipo減輕了bergapten的毒性（圖3A-B）?；?死染色進(jìn)一步證明了Ber-lipo在40 μM濃度下的良好生物相容性（圖3C-D）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，溶血試驗(yàn)顯示Ber-lipo的溶血比率低于5%（圖3E），HE染色結(jié)果顯示心臟、腎臟、肝臟和脾臟組織無(wú)明顯病理變化，確認(rèn)了其體內(nèi)安全性（圖3F）。Ber-lipo的安全性源于其脂質(zhì)體載體，尤其是DPPC成分，有助于藥物靶向肺部并減少毒性。

圖3 Ber-lipo在體內(nèi)和體外均具有良好的生物相容性。(A、B) 分別在 RAW264.7 和 HUVEC 細(xì)胞中進(jìn)行 CCK-8 測(cè)定。(C) HUVEC 中的活細(xì)胞/死細(xì)胞染色。 (D) HUVEC 中的細(xì)胞骨架染色。使用共聚焦顯微鏡。(E) Ber-lipo 的溶血率測(cè)定。(F) 使用 HE 染色對(duì) LPS 誘導(dǎo)的 ALI 小鼠的心臟、肝臟、脾臟和腎臟進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估。

(3) Ber-lipo調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化平衡以改善ALI炎癥

研究人員通過(guò)評(píng)估Ber-lipo對(duì)M1/M2巨噬細(xì)胞極化的影響，發(fā)現(xiàn)Ber-lipo能夠有效維持巨噬細(xì)胞的極化平衡，從促炎狀態(tài)向抗炎狀態(tài)轉(zhuǎn)變。免疫熒光染色（圖4A）顯示，LPS刺激后M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86表達(dá)增加，而B(niǎo)er-lipo處理顯著減少，同時(shí)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD163表達(dá)增加。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖4B）表明，Ber-lipo處理后，CD86⁺ M1巨噬細(xì)胞比例從模型組的8.11%降至3.22%，而CD163⁺ M2巨噬細(xì)胞比例從25.9%升至73.1%。Western blot（圖4C & D）和qRT-PCR（圖4E-L）進(jìn)一步證實(shí)，Ber-lipo減少了M1標(biāo)志物及其炎癥因子的表達(dá)，增加了M2相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。這些結(jié)果表明，Ber-lipo通過(guò)調(diào)節(jié)M1/M2極化，具有抗炎作用，可能對(duì)ALI及其他炎性疾病具有治療潛力。

圖4 Ber -lipo在體外對(duì)維持 M1 和 M2 巨噬細(xì)胞極化平衡的影響。（A）通過(guò)免疫熒光染色顯示 RAW264.7 細(xì)胞中 CD86 標(biāo)記的M1 和 CD163 指示的 M2 的分布。（B）通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞中 CD86 ⁺ M1 和 CD163⁺ M2 的比例。（C）通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) RAW264.7 細(xì)胞中 CD86 和 CD163 的蛋白質(zhì)表達(dá)。（D）通過(guò) imageJ 軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行量化。 (E–L) 使用 qRT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)化 CD86、iNOS、CD206、IL-6、IL-1β、TNF-α、CCL22 和 CCL24 的 mRNA 表達(dá)。內(nèi)部控制，α-微管蛋白。M1 表型標(biāo)記：CD86、iNOS、IL-6、IL-1β 和 TNF-α。M2 表型標(biāo)記：CD163、CD206、CCL22 和 CCL24

(4) Ber-lipo 對(duì)體外上皮和內(nèi)皮完整性的保護(hù)作用

該團(tuán)隊(duì)通過(guò)評(píng)估Ber-lipo對(duì)內(nèi)皮和上皮屏障完整性的保護(hù)作用，特別是ZO-1蛋白的表達(dá)，探討其對(duì)ALI的修復(fù)效果。免疫熒光染色（圖5A）顯示，在MLE-12和HUVEC細(xì)胞中，模型組ZO-1蛋白（紅色）表達(dá)顯著減少、破裂或排列不規(guī)則，表明細(xì)胞通透性增加；而在bergapten和Ber-lipo處理組，ZO-1蛋白密封了細(xì)胞間隙，恢復(fù)了屏障完整性。進(jìn)一步的Western blot分析（圖5B）顯示，模型組ZO-1表達(dá)顯著降低，而藥物處理組恢復(fù)了ZO-1的表達(dá)，Ber-lipo效果優(yōu)于bergapten。這些結(jié)果表明，Ber-lipo在體外能夠有效修復(fù)ALI引起的上皮和內(nèi)皮屏障損傷。