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糖尿傷口愈合延遲是由于組織收縮力降低造成的，高血糖和缺氧微環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞存活和遷移受到嚴(yán)重抑制，這影響了傷口愈合。對(duì)溫度變化作出反應(yīng)的溫度敏感水凝膠已顯示出通過機(jī)械收縮促進(jìn)傷口愈合的前景。然而，已報(bào)道的水凝膠敷料在濕潤(rùn)損傷部位通常反應(yīng)緩慢、機(jī)械收縮不足，從而限制了其療效。同時(shí)，由于高度交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)和有限的生物活性，這些材料通常無(wú)法在維持細(xì)胞活力和促進(jìn)細(xì)胞遷移的同時(shí)對(duì)傷口提供快速、變化的牽引力。此外，人間充質(zhì)干細(xì)胞 (hMSC) 分泌各種細(xì)胞因子和趨化因子，可減少細(xì)胞凋亡、恢復(fù)受損的組織彈性并刺激組織和血管再生。與 MSC 相比，通過細(xì)胞出芽和質(zhì)膜融合產(chǎn)生的外泌體表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性、更低的免疫排斥和更容易內(nèi)化到受體細(xì)胞中，使其在臨床應(yīng)用中前景廣闊。但由于外泌體體積小、易擴(kuò)散，在傷口或表皮上的有效停留時(shí)間有限，因此設(shè)計(jì)合適的載體對(duì)外泌體的持續(xù)遞送具有重要意義。

針對(duì)上述問題，華南理工大學(xué)邊黎明/張琨雨教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種具有強(qiáng)大組織黏附力的新型自收縮活性核-殼微凝膠組裝體（SMART-EXO），以加速糖尿病傷口愈合。由于豐富的氫和動(dòng)態(tài)配位鍵，SMART-EXO 敷料對(duì)受損組織表現(xiàn)出強(qiáng)大的可逆粘附性。此外，核殼微凝膠成分和動(dòng)態(tài)配位鍵提供中等剛度、可定制的自收縮和相互連接的多孔結(jié)構(gòu)。SMART-EXO 敷料觸發(fā)的原位自收縮可實(shí)現(xiàn)主動(dòng)、可調(diào)節(jié)的傷口收縮，激活皮膚中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)并促進(jìn)最佳的成纖維細(xì)胞到肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、膠原蛋白合成和血管生成。同時(shí)，SMART-EXO 的觸發(fā)收縮有助于有效裝載和按需釋放生物活性外泌體，有助于糖尿病小鼠的再上皮化和傷口微環(huán)境調(diào)節(jié)。RNA 測(cè)序結(jié)果揭示了與機(jī)械傳感和外泌體調(diào)節(jié)相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路的激活，突出了生物力學(xué)和生化機(jī)制的結(jié)合。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了 SMART-EXO 是一種多功能、適應(yīng)性強(qiáng)的解決方案，可應(yīng)對(duì)糖尿病傷口護(hù)理的復(fù)雜挑戰(zhàn)。該文章于2024年7月23日以《In Situ Triggered Self-Contraction Bioactive Microgel Assembly Accelerates Diabetic Skin Wound Healing by Activating Mechanotransduction and Biochemical Pathway》為題發(fā)表于《Advanced Materials》上（DOI: 10.1002/adma.202406434）。

（1）具有強(qiáng)組織粘附性的自收縮微凝膠組裝體的制造和表征（SMART）

該研究團(tuán)隊(duì)首先使用N-異丙基丙烯酰胺 (NIPAM) 和丙烯酸 (AAC) 單體，通過改進(jìn)的沉降聚合制備了 NIPAM-co-AAC 微凝膠（圖 1A、B）。透射電子顯微鏡 (TEM) 圖像顯示微凝膠具有核殼結(jié)構(gòu)（圖 1C），動(dòng)態(tài)光散射 (DLS) 顯示其流體動(dòng)力學(xué)直徑為 1.83 μm（圖 1D）。微凝膠尺寸隨溫度升高而縮小，在約 37°C 的低臨界溶解溫度 (LCST) 時(shí)顯著下降（圖 1E），歸因于聚合物鏈的親水和疏水基團(tuán)共存。加入EDC后，微凝膠進(jìn)一步自組裝形成自收縮微凝膠組裝體 (SMA)。共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像顯示，單分散微凝膠逐漸聚集形成幾十微米大小的結(jié)構(gòu)，最終形成大的微凝膠組裝體（圖 1F）。48小時(shí)后，獲得圓盤狀多孔結(jié)構(gòu)，由緊密堆積的微凝膠構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)（圖 1G，H）。

隨后，為增強(qiáng)組織粘附性，在 SMA 中引入聚丙烯酸 (PAA) 和 Ca²⁺ 的二級(jí)網(wǎng)絡(luò)生成 SMART（圖 1I）。與 SMA 中微凝膠的光滑表面相比，SMART 的橫截面上顯示出相互連通的多孔結(jié)構(gòu)（圖 1J）。傅里葉變換紅外光譜 (FT-IR) 分析在 1731、1779、1810 cm^-1 處出現(xiàn)的特征峰對(duì)應(yīng) NHS 酯和酰亞胺的 C═O 伸縮振動(dòng)（圖 1K）。PAA 網(wǎng)絡(luò)的引入增強(qiáng)了 SMART 在 1712 cm^-1 的 C═O 吸收峰。流變分析顯示儲(chǔ)能模量（G′）始終大于損耗模量（G″），符合塊狀凝膠特性（圖 1L）。SMA 和 SMART 的強(qiáng)烈頻率依賴性揭示了體系內(nèi)的超分子相互作用。由于 PAA-Ca²⁺ 網(wǎng)絡(luò)的加入，SMART 在應(yīng)變掃描中表現(xiàn)出更高的 G′值和更高的屈服點(diǎn)（圖 1M）。此外，時(shí)間掃描測(cè)試證實(shí)了 SMART 的優(yōu)異剪切稀化和自修復(fù)性能，與切割和重新連接實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（圖 1N，O）。SMART 還表現(xiàn)出快速溫度響應(yīng)，有助于傷口機(jī)械收縮，其自修復(fù)性來(lái)源于羧基之間的氫鍵以及羧基與 Ca²⁺ 間的動(dòng)態(tài)配位，并通過調(diào)節(jié)交聯(lián)密度即可調(diào)節(jié)其力學(xué)性能。

圖1.微凝膠的組裝導(dǎo)致了表現(xiàn)出優(yōu)異機(jī)械性能的 SMART 的形成。A) SMART 制造過程示意圖。B) 熒光標(biāo)記微凝膠的 CLSM 圖像。C) 顯示微凝膠核殼結(jié)構(gòu)的 TEM 圖像。D) 通過 DLS 獲得的微凝膠的尺寸分布。E) 描繪微凝膠的流體動(dòng)力學(xué)直徑與溫度關(guān)系的圖表。F) 時(shí)間相關(guān) CLSM 圖像顯示添加 EDC 后微凝膠的組裝過程。G) 顯示塊體 SMA 的圓盤狀形態(tài)的光學(xué)圖像。H) SMA 的 SEM 圖像顯示其內(nèi)部多孔形態(tài)。I) SMART 的宏觀形態(tài)。J) SMART 剖面結(jié)構(gòu)的 SEM 圖像。K) 微凝膠、SMA 和 SMART 的 FT-IR 光譜。L、M) 使用頻率掃描和應(yīng)變掃描對(duì) SMA 和 SMART 進(jìn)行流變分析。N) SMART 的循環(huán)應(yīng)變圖。 O) 光學(xué)圖像展示了 SMART 的自修復(fù)特性

（2）智能敷料通過程序化自我收縮實(shí)現(xiàn)外泌體的自發(fā)加載和持續(xù)釋放

與微凝膠固有的觸發(fā)自收縮特性一致，SMART 敷料在接近正常體溫時(shí)會(huì)瞬時(shí)自收縮（圖 2A）。在 37°C 下，其直徑（d1/d0、h1/h0）分別縮小至 54.48％ 和 55.12％（圖 2B）。隨著鈣濃度的增加，SMART hc 敷料在 EDS 圖中顯示更強(qiáng)的 Ca Kα1 信號(hào)，且體積收縮減少（圖 2C-E）。為利用外泌體的皮膚修復(fù)能力，提取了 hMSC 分泌的外泌體，大小分布為 30-200 nm（圖 2F），并通過 CD81 和 β-actin 的標(biāo)記驗(yàn)證純度（圖 2G）。TEM 和 SEM 圖顯示其杯狀囊泡結(jié)構(gòu)，表明外泌體收集成功（圖 2H、I）。當(dāng)環(huán)境溫度低于 SMART 的 LCST 時(shí)，酰胺基團(tuán)與水形成氫鍵，促進(jìn)體積膨脹和外泌體擴(kuò)散并有效裝載；高于 LCST 時(shí)，氫鍵斷裂引發(fā)體積收縮，釋放外泌體（圖 2J）。CLSM 圖像顯示熒光標(biāo)記的外泌體在 SMART 內(nèi)均勻分布并保持穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá) 14 天，超 90％ 外泌體可順暢釋放，尤其在最初 3 天內(nèi)持續(xù)釋放（圖 2K、L）。SMART-EXO 保持與 SMART 相似的機(jī)械性能，且粘度隨剪切速率增加呈線性下降（圖 2M-O）。綜上，SMART 通過自收縮有效負(fù)載干細(xì)胞衍生外泌體，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定釋放，同時(shí)不影響機(jī)械性能。

圖2.SMART 能夠在溫度變化下自發(fā)裝載和持續(xù)釋放外泌體。A) SMA 的可編輯自收縮和強(qiáng)大的組織粘附性。B) SMART 和 SMART_hc在 0 或 37 ℃ 下 10 min在 TCPS 上的照片。C) SMART 和 SMART_hc橫截面上鈣分布的 EDS 映射。D) SMART 和 SMART_hc橫截面上記錄的鈣定量的 EDS 映射。E) 比率d 1 / d 0和h 1 / h 0量化 SMART 和 SMART hc ( n = 3)不同軸上的收縮比率。F) 外泌體直徑大小分布直方圖。G) Western blot。H) SEM 圖像I) TEM 圖像。J) SMART 通過響應(yīng)溫度變化的瞬時(shí)自我收縮來(lái)裝載和釋放外泌體的示意圖。K) SMART-EXO（n ≥ 5）中外泌體的累積釋放曲線。L) CLSM 圖像。M) SMART-EXO 敷料的機(jī)械性能。N) SMART-EXO 的振蕩應(yīng)變掃描。O) 剪切作用下 SMART-EXO 的粘度變化

（3）SMART-EXO 敷料具有優(yōu)異的粘附性和原位觸發(fā)自收縮功能，可增強(qiáng)傷口閉合

當(dāng)應(yīng)用于濕潤(rùn)和受傷組織時(shí)，SMART-EXO 敷料中的羧基能迅速與皮膚組織中的胺基形成氫鍵，10秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定粘附。該敷料在豬皮和心臟樣本上表現(xiàn)出強(qiáng)大粘附力，即使在扭曲、彎曲或沖洗下仍保持牢固（圖 3A、B）。在彎曲或浸泡于 PBS 12小時(shí)后，該敷料仍能緊密附著于雞皮樣本（圖 3C）。特別是，SMART-EXO 敷料可有效粘附在充滿模擬腸液（SIF）的受損豬腸外表面，并通過自我收縮密封傷口（圖 3D）。在豬皮上的剪切強(qiáng)度和傷口閉合強(qiáng)度分別超過 56 kPa 和 1.5 N，平均界面韌性為 81 J m ^?2。值得注意的是，噴灑生物相容性碳酸氫鈉溶液后，界面韌性降至 11.94 J m ^?2，便于非侵入性去除敷料（圖 3F）。

此外，SMART-EXO 敷料在接近正常體溫下能快速自收縮，主動(dòng)縮小傷口面積（圖 3G）。體外測(cè)試顯示，在離體糖尿病小鼠皮膚上的直徑8毫米傷口區(qū)域，敷料在 37°C 下立即收縮，使傷口軸徑（d1/d0、h1/h0）分別減小至 55.18％ 和 56.58％（圖 3H）。當(dāng)鈣濃度增高時(shí)，SMART hc-EXO 敷料實(shí)現(xiàn)了溫和的傷口收縮，d1/d0 和 h1/h0 分別降至 77.1％ 和 74.3％（圖 3H）。與市售傷口敷料相比，SMART-EXO 表現(xiàn)出更強(qiáng)的粘附性，其更高的剪切強(qiáng)度、傷口閉合強(qiáng)度和界面韌性均顯著提升（圖 3E）。通過簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)交聯(lián)點(diǎn)密度，SMART-EXO 可實(shí)現(xiàn)自收縮過程的精確控制，從而編程化調(diào)節(jié)傷口機(jī)械收縮。

圖3.  SMART-EXO 表現(xiàn)出優(yōu)異的粘附性、可觸發(fā)分離和可編程的自收縮，可用于皮膚傷口閉合。SMART-EXO 與 A) 豬皮、B) 豬心、C) 雞皮和 D) 豬腸的粘附性。E) SMART-EXO 在濕豬皮上的剪切強(qiáng)度、傷口閉合強(qiáng)度和界面韌性。F) 圖表說(shuō)明了 SMART-EXO 的濕粘附和可觸發(fā)分離。G) SMART-EXO 或 SMART hc -EXO 通過外泌體釋放促進(jìn)傷口愈合的示意圖。 H) SMART-EXO 或 SMART hc -EXO 在 0 或 37 °C 下 10 分鐘時(shí)在離體糖尿病小鼠皮膚傷口表面的照片；比率d 1 / d 0和h 1 / h 0量化了傷口或傷口hc不同軸的收縮率

（4）SMART-EXO 敷料通過結(jié)合生物力學(xué)和生化線索加速糖尿病傷口閉合

為評(píng)估傷口的機(jī)械收縮及外泌體釋放對(duì)糖尿病傷口愈合的影響，在糖尿病 db/db 小鼠的全層切除傷口上分別施用 SMART-EXO 敷料（“SMART-EXO”組）、普通 SMART 敷料（“SMART”組）和外泌體懸浮液（“EXO”組），未處理傷口作為對(duì)照（圖 4A）。結(jié)果顯示，SMART-EXO 組的愈合速度最快（圖 4B），至第16天傷口面積僅為初始的 8.3% ± 3.20%（圖 4C）。SMART 組（37.00% ± 5.65%）和 EXO 組（46.16% ± 13.59%）的傷口面積顯著小于對(duì)照組（68.35% ± 11.38%），表明機(jī)械線索和外泌體的生化線索均促進(jìn)了傷口閉合。蘇木精-伊紅染色分析顯示，第8天 SMART-EXO 組的表皮厚度為145 μm，高于 SMART 組（107 μm）、EXO 組（110 μm）和對(duì)照組（27 μm）（圖 4D、E）。然而，第16天時(shí)，SMART-EXO 組的表皮層最薄（圖 4F）。相較對(duì)照組，SMART 和 SMART-EXO 組表現(xiàn)出更多的膠原沉積，且 SMART-EXO 組膠原束更有序，表明成熟膠原束的存在（圖 4I）。此外，SMART-EXO 組的 CD31 和 α-SMA+ 表達(dá)顯著高于其他組（圖 4G、H、J、K），表明通過 SMART-EXO 敷料的機(jī)械收縮改變傷口應(yīng)力水平，有助于血管生成和肌成纖維細(xì)胞再生。結(jié)果表明，SMART-EXO 敷料可通過提供機(jī)械收縮和外泌體，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜皮膚結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的有效重建。糖尿病小鼠傷口模型證實(shí)，SMART-EXO 敷料能加速傷口愈合，且無(wú)明顯不良影響。

圖4. SMART-EXO 敷料可加速 db/db 小鼠的傷口愈合。A) 全層切除傷口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。B) 用 SMART 和 SMART-EXO 治療 16 天的傷口代表性圖像。C) 16 天內(nèi)殘留傷口大小的量化。D) 第 8 天和第 16 天傷口皮膚的蘇木精-伊紅染色。E、F) 傷口皮膚表皮厚度的量化I) 小鼠組織切片 Masson 三色染色的代表性圖像。 J) CD31 和 K) α-SMA +在第 16 天的代表性免疫熒光圖像。G、H)第 16 天 ( n ≥ 4) 的 G) CD31 和 H) α-SMA +的相對(duì)面積覆蓋率

5）SMART-EXO 敷料通過激活皮膚機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)和促進(jìn)血管生成和上皮再生來(lái)加速糖尿病皮膚傷口愈合

  與 SMART 組相比，在第16天，SMART-EXO 組顯示出磷酸化 PI3K (p-PI3K)、磷酸化 RAF (p-RAF)、磷酸化 AKT (p-AKT) 和磷酸化 Erk1/2 (p-Erk1/2) 的顯著上調(diào)（圖 5A、B），表明 EXO 可能激活了 PI3K/AKT 和 MAPK/Erk 通路（圖 5C）。主成分分析（PCA）顯示對(duì)照組、SMART 組和 SMART-EXO 組之間的轉(zhuǎn)錄組譜存在差異性聚類（圖 5D）。差異基因表達(dá)分析顯示，SMART 組相比對(duì)照組有 3609 個(gè)顯著修飾基因（2138 個(gè)上調(diào)），SMART-EXO 組有 1888 個(gè)基因（1173 個(gè)上調(diào)），SMART-EXO 與 SMART 相比有 811 個(gè)基因（410 個(gè)上調(diào)）（圖 5E-G）。信號(hào)通路富集分析顯示，SMART-EXO 組在 PI3K/AKT、MAPK 和 HIF-1 通路中表現(xiàn)出顯著富集（圖 5H），表明 EXO 在細(xì)胞增殖、血管生成和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。此外，與對(duì)照組相比，SMART-EXO 在 TGF-β/Smad 和 Hippo 等與機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的通路中表現(xiàn)出反應(yīng)富集（圖 5I），暗示 SMART 引發(fā)的機(jī)械收縮可促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化、膠原形成和組織發(fā)育。GO 分析進(jìn)一步表明，SMART-EXO 相比 SMART 組在細(xì)胞增殖、遷移和血管重塑等多個(gè)過程中的基因富集（圖 5J）。此外，SMART-EXO 組在肌肉收縮、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組、平滑肌組織發(fā)育、上皮細(xì)胞遷移、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成等方面顯示出富集（圖 5K）。整體而言，這些結(jié)果表明，SMART-EXO 敷料通過機(jī)械和生化雙重調(diào)節(jié)加速了糖尿病小鼠皮膚傷口的多種修復(fù)過程，包括細(xì)胞遷移、增殖、血管生成和再上皮化（圖 6）。

圖5. SMART-EXO 通過促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、血管生成和上皮化來(lái)加速糖尿病皮膚傷口愈合。A) 受傷后第 16 天傷口皮膚組織裂解物中 p-PI3K、p-RAF、p-AKT、p-Erk1/2 和 β-actin 的免疫印跡。B) 第 16 天傷口皮膚中 p-PI3K、p-RAF、p-AKT 和 p-Erk1/2 的相對(duì)蛋白表達(dá)水平。C) SMART-EXO 激活的 AKT 和 Erk1/2 通路示意圖。D) 主成分分析 (PCA) 圖?；鹕綀D顯示 E) SMART 與對(duì)照、F) SMART-EXO 與對(duì)照和 G) SMART-EXO 與 SMART 的基因差異表達(dá)譜。使用 H、I) Reactome 和 J、K) 基因本體 (GO) 數(shù)據(jù)庫(kù)中的 SMART-EXO 與 SMART 和 SMART-EXO 與 SMART 的表達(dá)基因進(jìn)行功能過度表達(dá)分析

圖6.SMART-EXO 加速傷口愈合的機(jī)制

研究小結(jié)：

該研究通過整合 MSC 衍生外泌體于自收縮核殼微凝膠組件中，開發(fā)出一種多功能生物活性核殼微凝膠組件 (SMART-EXO)，具備強(qiáng)大組織粘附性。SMART-EXO 具備可逆濕生物粘附性，其粘附性優(yōu)于多種現(xiàn)有產(chǎn)品，如醫(yī)用敷料、透明敷料、手術(shù)密封劑和貼片，并可輕松無(wú)創(chuàng)移除。體外實(shí)驗(yàn)顯示，SMART-EXO 通過可調(diào)節(jié)自收縮和持續(xù)外泌體釋放，具備促進(jìn)傷口愈合的潛力。在 II 型糖尿病小鼠模型中，SMART-EXO 通過激活皮膚機(jī)械傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、血管生成及肌肉收縮相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路，加速傷口閉合。該系統(tǒng)在慢性糖尿病傷口護(hù)理及其他受損組織的緊急止血中展現(xiàn)出巨大臨床應(yīng)用前景。