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術后粘連是由于創(chuàng)傷組織與相鄰組織或器官之間病理性連接而引起的，最常見于腹腔、心包、肝臟、腱和子宮等部位。其中，腹腔粘連尤為關注，因為其發(fā)病率高，且腹部手術的數量逐漸增加。據統(tǒng)計，93%的腹部手術患者會發(fā)生腹腔粘連。雖然通過粘連松解術可以機械性地移除粘連，但這也增加了復發(fā)性粘連的風險，原因包括手術創(chuàng)傷、出血和感染。腹腔粘連可能導致女性不孕、嘔吐、腹痛和小腸梗阻等并發(fā)癥，每年因此增加了30萬次手術，并造成數十億美元的醫(yī)療費用。因此，開發(fā)有效的預防腹腔粘連和復發(fā)性粘連的策略至關重要。目前，臨床上用于預防術后腹腔粘連的策略主要分為藥物治療和物理屏障兩類。常見的預防腹腔粘連的藥物，如抗炎藥物、膠原蛋白抑制劑和纖溶劑，通常效果不佳，因為它們在腹腔內代謝迅速。物理屏障系統(tǒng)通過隔離受創(chuàng)組織和相鄰組織，防止粘連的發(fā)生。然而，現有的商業(yè)化屏障產品在預防效果上表現有限，例如Seprafilm和Interceed等屏障膜由于停留時間短和實際使用限制，無法保證有效結果。同樣，Adept（愛得普）聚合物溶液由于粘度低，難以有效附著于腹膜，因此在預防粘連方面效果欠佳。相比之下，水凝膠因其高度適應性和與腹腔鏡手術的兼容性，顯示出更大的應用前景。

針對上述問題，西安交通大學的王珂團隊開發(fā)了一種新型抗污注射水凝膠（CGM水凝膠），其通過甲基丙烯酸酯硫酸軟骨素（CS-GMA）和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸膽堿（MPC）單體的自由基聚合制備。CGM水凝膠的加入大大提高了抗污能力和親水性。此外，硫酸軟骨素（CS）通過甲基丙烯酸化破壞分子間氫鍵，促進快速水化。相關研究表明，CGM水凝膠不僅表現出良好的生物相容性，而且有效地預防了術后腹腔粘連。相關研究在2024年6月8日以“An injectable and antifouling hydrogel prevents the development of abdominal adhesions by inhibiting the CCL2/CCR2 interaction”為題發(fā)表于《Biomaterials》（DOI: 10.1016/j.biomaterials.2024.122661）。

圖1 研究示意圖

（1）CGM水凝膠的制備與表征

本研究通過熱引發(fā)共聚合合成了CGM水凝膠，主要成分包括CS-GMA和MPC。水凝膠展示了良好的自愈能力和抗污性能，能夠有效減少非特異性蛋白質和細胞吸附。¹H NMR和FT-IR分析驗證了CS-GMA的成功合成，接枝率為36%。FT-IR顯示了氫鍵的存在和結構變化。流變測試顯示，CGM水凝膠在0–300秒內保持穩(wěn)定的儲能模量（G'）和損耗模量（G"），展現出優(yōu)異的剪切稀化行為，適合腹腔鏡手術。步進應變掃描測試證實了水凝膠的自愈性能，特別是CGM-2水凝膠表現出更優(yōu)的機械性能。通過添加尿素和氯化鈉，進一步確認了水凝膠中的氫鍵和靜電相互作用。頻率掃描和時間掃描測試表明，CGM水凝膠在60 Hz以下表現出良好穩(wěn)定性，并在50至100秒間完成溶膠-凝膠轉變。

圖2 CGM水凝膠的制備與表征

（2）CGM水凝膠的抗污能力

在腹腔植入過程中，非特異性蛋白質吸附和細胞附著是水凝膠面臨的主要挑戰(zhàn)。為評估CGM水凝膠的抗污能力，實驗將L929和RAW264.7細胞與CGM水凝膠和TCPS共同孵育23小時，結果顯示TCPS表面有大量細胞附著，而CGM水凝膠表面幾乎沒有細胞附著。這是因為CGM水凝膠表面的MPC形成了致密的水合層，阻礙了帶電蛋白質和細胞的附著。進一步的蛋白吸附測試使用牛血清白蛋白（BSA）和纖維蛋白原進行。結果顯示，CGM水凝膠相比純硫酸軟骨素（PCS）水凝膠顯著減少了BSA和纖維蛋白原的吸附，尤其是CGM-2水凝膠表現出更強的抗吸附能力。此外，CGM水凝膠對紅細胞的附著能力也較低，CGM-2和CGM-1水凝膠的表面顏色明顯淺于PCS和CGM-3。這些結果表明CGM水凝膠在防止非特異性蛋白質吸附和細胞附著方面表現優(yōu)異，CGM-2水凝膠在各項測試中表現最佳，因此被選為后續(xù)實驗的主要研究對象。

圖3 CGM水凝膠的防污能力

（3）CGM水凝膠的生物相容性

CGM水凝膠的生物相容性是其應用于體內的關鍵因素。MTT測試結果顯示，L929和HMrSV5細胞在不同濃度的CGM-2水凝膠中培養(yǎng)后，細胞活力均保持在80%以上，表明CGM-2水凝膠具有良好的生物相容性?；?死細胞熒光染色的共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）圖像進一步證實了這一點，兩種細胞在CGM-2水凝膠中均顯示出綠色熒光（活細胞），且與TCPS培養(yǎng)的細胞相比，未見明顯的形態(tài)和數量差異。此外，CGM-2水凝膠的溶血實驗結果顯示，紅細胞懸液的溶血率低于5%，表明其在術后應用中的潛力。通過對SD大鼠主要器官的H&E染色和Masson三色染色分析，結果顯示CGM水凝膠組與正常組相比，無明顯的生理差異。心肌細胞排列整齊，無炎癥跡象，肝竇無肥大或充血，脾組織正常，肺組織無肺泡擴張或塌陷，腎組織中正常腎小管和腎小球清晰可見。這些結果表明CGM水凝膠具有優(yōu)異的體內生物相容性，且其成分及其降解產物在體內不會對細胞和器官產生毒性。

圖4 CGM水凝膠的生物相容性

（4）CGM水凝膠預防術后粘連的效果

為了評估CGM-2水凝膠在預防術后粘連中的效果，建立了大鼠體內腹腔粘連模型和復發(fā)性腹腔粘連模型。在模型中，通過在受損區(qū)域直接涂抹CGM-2水凝膠以預防粘連。研究發(fā)現，CGM組在第5天的粘連評分為0.5，顯示出較少的粘連形成，而對照組的粘連評分達到9.8，第10天更為嚴重。相比之下，使用HA水凝膠的組在第5天的粘連評分為3.8，但仍有部分粘連殘留。在復發(fā)性粘連模型中，對比復發(fā)性粘連和初次粘連，復發(fā)性粘連通常更加廣泛和堅固。研究表明，未接受任何干預的對照組在黏連松解后第5天的粘連評分為10.0，表明復發(fā)性粘連幾乎不可避免。而HA組的平均粘連評分為5.0，CGM水凝膠組幾乎沒有粘連。此外，由于CGM-2水凝膠可在10天內完全降解，進一步研究了其在完全降解后的防粘連效果。第14天時，CGM組的平均粘連評分為1.5，顯示出較少的粘連形成。血液分析結果進一步證明了CGM水凝膠的體內生物相容性和血液相容性?？傮w結果表明，CGM水凝膠可以有效預防初次和復發(fā)性腹腔粘連。

圖5 CGM水凝膠在體內預防腹腔形成的效果

（5）CGM水凝膠的病理分析

粘連組織H&E和Masson染色的病理結果顯示，第5天，模型組顯示出廣泛的粘連組織，盲腸肌肉與腹膜緊密粘連，伴有肉芽組織增生、大量新生血管和纖維結締組織的生長。H&E和Masson染色檢測到大量炎性細胞、空泡樣結構和膠原沉積。第10天，模型組的膠原和纖維結締組織變得更厚、更廣泛，顯示出不可逆的粘連形成。相比之下，HA組在第5天的粘連顯著減少，但間皮細胞排列仍然紊亂。第10天，受損的腹膜和盲腸之間仍有部分結締組織和膠原沉積，表明HA水凝膠在抑制粘連形成方面的效果有限。CGM組的結果顯示，腹膜和盲腸在第5天和第10天完全分離，且再生組織類似于正常組，炎性細胞浸潤和膠原沉積最少。這些發(fā)現表明CGM水凝膠能有效防止初次粘連的形成并促進組織再生。在經歷粘連松解手術的大鼠中，觀察到更廣泛的粘連，伴有纖維結締組織和新生血管的形成。HA組顯示持續(xù)的纖維增生反應和炎性細胞積聚，證明商業(yè)HA水凝膠缺乏預防復發(fā)性粘連的能力。而CGM水凝膠組中，盲腸的間皮細胞層和肌肉與正常組相似，無明顯的炎性細胞積聚和膠原沉積。

圖6 粘連組織在粘連松解后第5天、第10天和第5天經不同處理后的代表性H&E和Masson三色染色。CE：盲腸粘膜；AW：腹壁。比例尺：300 μm

（6）CGM水凝膠防止粘連的潛在機制

為深入探討CGM水凝膠防止粘連的潛在機制，進行了轉錄組學和蛋白質組學分析。主成分分析（PCA）顯示，正常組與模型組有明顯差異。通過轉錄組學分析鑒定的14144個基因中，11963個基因在所有組中表達，而模型組和CGM組中分別有425和371個特異性表達基因。熱圖和火山圖揭示了一些與粘連形成密切相關的基因，包括TGF-βR1，它可以通過經典的Smad信號通路參與和調節(jié)細胞增殖、分化和纖維化過程。蛋白質組學分析進一步證實了這一點，模型組與CGM組和正常組的蛋白表達譜存在顯著差異?；鹕綀D顯示，模型組中CCL2、CCR2、VIM和FN1等基因表達顯著上調，而CGM水凝膠顯著下調了CCL2和CCR2的表達。CCL2與其受體CCR2的結合可促進細胞遷移，包括巨噬細胞、成纖維細胞等，這是粘連形成的關鍵因素。

圖7 使用轉錄組學分析分析差異基因表達（n = 3）

免疫熒光染色結果顯示，模型組中CCL2和CCR2的表達顯著增加，而CGM水凝膠處理組顯著減少。此外，Western-blot和RT-PCR結果顯示，CGM水凝膠顯著抑制了CD68和波形蛋白的表達，這表明其有效地抑制了巨噬細胞和成纖維細胞的遷移。

圖8 CGM水凝膠對CCL2/CCR2相互作用的影響

圖9 CGM 水凝膠對 CD68/Vimentin 表達的影響

進一步的分析顯示，CGM水凝膠處理組中TNF-α的表達顯著降低，而IL-10的表達增加，表明其具有良好的抗炎作用。模型組中觀察到較少的t-PA表達和大量的PAI-1表達，而CGM水凝膠組則相反。CGM水凝膠處理后，Col I的表達減少，MMP-9的表達增加。此外，CGM水凝膠還顯著降低了TGF-βR1的表達。這些結果表明，CGM水凝膠能夠調節(jié)ECM的降解和纖維蛋白溶解的平衡，從而有效防止腹腔粘連的形成。

圖10 水凝膠處理后粘連組織炎癥因子和受體的表達水平

圖11 CGM水凝膠對t-PA/PAI-1平衡的影響

圖12 CGM 水凝膠對膠原降解的影響

（7）CGM水凝膠的體內滯留時間

抗粘連屏障的生物降解性是關鍵因素，滯留時間過短會降低效果，而過長則可能引發(fā)異物反應。為了評估CGM-2水凝膠的體內滯留時間，采用了體內成像和磁共振成像（MRI）。在腹腔內注射后，標記有Cy7的CGM-2水凝膠在大鼠腹腔中顯示出強烈的熒光信號。結果顯示，CGM-2水凝膠在注射3天后殘留約37%，7天后殘留約24%，表明其在腹腔內逐漸降解。到第10天，熒光信號減弱并幾乎消失。為進一步評估體內降解情況，將CGM-2水凝膠植入皮下并進行T1加權信號的MRI評估。結果顯示，CGM-2水凝膠的信號從第0天到第7天可觀察到，10天時顯著減少，14天時幾乎不可見，表明CGM-2水凝膠在體內的滯留時間約為10至14天，與活體成像結果一致。此外，還對CGM-3水凝膠的體內成像進行了研究，以探索CGM水凝膠降解的可調性。如圖S16A所示，CGM-3水凝膠在腹腔內注射后，3天時殘留約76%，7天時殘留約56%。第10天時，CGM-3水凝膠的熒光信號減弱到27%，14天時幾乎消失。這表明CGM-3水凝膠在體內具有較長的降解時間，可能是由于其更致密的交聯網絡。該結果顯示CGM水凝膠具有良好的降解時間可調性，為其在其他生物領域的應用提供了廣闊的前景。

圖13 CGM-2 水凝膠的生物降解性

小結：

本研究設計并制備了一種由CS-GMA和MPC單體組成的可注射抗污CGM水凝膠，用于預防術后腹腔粘連和肝臟粘連。CGM水凝膠展示了優(yōu)異的抗污和自愈特性，這歸因于其可逆氫鍵和靜電相互作用網絡。此外，MPC的加入在CGM水凝膠周圍形成了致密的水合層，顯著防止了非特異性蛋白吸附和細胞附著。體外降解和細胞實驗證明了該水凝膠的優(yōu)異生物相容性和理想的降解時間。在腹腔和肝臟粘連模型中，CGM水凝膠有效防止了術后粘連的形成。機制研究表明，CCL2/CCR2的相互作用影響巨噬細胞和成纖維細胞的募集以及ECM的沉積，這些都與粘連的形成有關。CGM水凝膠顯著下調了CCL2/CCR2的表達，通過物理屏障和細胞因子調控的協(xié)同作用防止了腹腔粘連。這種創(chuàng)新的可注射水凝膠為術后粘連預防提供了一種可行且有前景的策略。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961224001959#appsec1