團隊最新研究進展：一種新型3D打印雙層顱骨腦補片促進腦損傷修復(fù)和骨組織再生
專欄：學(xué)術(shù)前沿
發(fā)布日期：2024-02-21
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創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是由頭部受到外力沖擊、震動或穿刺引起的一種嚴(yán)重腦部損傷，具有高死亡率。除了原發(fā)性損傷外，TBI還引發(fā)一系列繼發(fā)性損傷，包括腦水腫、顱內(nèi)壓升高、腦灌注不足和神經(jīng)功能惡化。目前臨床上采用去骨瓣減壓術(shù)來緩解TBI引發(fā)的顱內(nèi)壓升高，降低腦水腫并改善腦血流循環(huán)。然而，由于去骨瓣減壓術(shù)后受損腦實質(zhì)失去了顱骨屏障的保護，可能會導(dǎo)致腦實質(zhì)的二次損傷。因此，急需一種生物材料直接植入缺損部位，既能提供臨時保護，又能促進自體骨再生。近年來，研究使用水凝膠支架作為治療顱骨缺損的植入物，促進骨組織再生，但是水凝膠支架用于去骨瓣減壓術(shù)的同時促進TBI炎癥的改善仍是挑戰(zhàn)。
針對上述問題和挑戰(zhàn)，我們團隊利用3D打印技術(shù)制備了一種以甲基丙烯酰化絲素蛋白（SFMA）為水凝支架的仿生雙層顱-腦補片（SMB6），以實現(xiàn)顱骨缺損和創(chuàng)傷性腦損傷的同時修復(fù)。如圖1所示，雙層顱-腦補片的第一層加入高濃度介孔生物活性玻璃（MBG）以模仿天然骨骼多孔微環(huán)境并提供骨誘導(dǎo)環(huán)境，實現(xiàn)促進BMSCs的粘附、遷移、增殖和成骨分化。雙層顱-腦補片的第二層負載包裹M-CSF和IL-6 的仿生小膠質(zhì)細胞，避開血腦屏障的低遞藥率，直接改善 TBI 后的炎癥微環(huán)境同時促進血管和神經(jīng)功能改善，破壞繼發(fā)性傷害之間的級聯(lián)反應(yīng)實現(xiàn)對創(chuàng)傷性腦損傷治療的直接干預(yù)。
圖1 創(chuàng)傷性腦損傷修復(fù)及顱骨缺損再生的仿生雙層顱腦補片原理圖
圖2 仿生3d打印雙層顱腦貼片的表征
1）顱腦貼片具有相互連接的多孔微觀結(jié)構(gòu)，使MBG均勻分布在支架中
研究者發(fā)現(xiàn)MBG呈現(xiàn)均勻有序介孔球體而且MBG中的元素均勻地分布在球形納米粒子上；此外，SFMA/10%MBG水凝膠的表面形貌最粗糙。粗糙度越高，促進成骨作用更明顯因此，他們使用SFMA/10% MBG油墨作為貼片的第一層，成功打印出具有不同圖案和異質(zhì)結(jié)構(gòu)的雙層顱腦貼片。
圖3 仿生3d打印雙層顱腦貼片的體內(nèi)評價
2）3d打印的SFMA支架具有細胞相容性，促進細胞在支架上的粘附和增殖
研究者用BV2和巨噬細胞(Raw 264.7)共孵育SFMA水凝膠滲濾液，共培養(yǎng)24h后，細胞均表現(xiàn)出良好的增殖能力。二維培養(yǎng)1周后，支架表面覆蓋了大量活細胞，部分細胞在SFMA支架上生長出纖維觸須。并且通過phalloidin染色觀察到大量肌動蛋白微絲相互粘附，覆蓋整個3D支架；此外，研究者通過堿性磷酸酶(ALP)活性檢測發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞ALP活性隨MBG濃度升高而升高。SFMA/10%MBG組ALP陽性面積最大，表明MBG的加入增加了成骨分化的潛力。
圖4 SMB6促進腦損傷修復(fù)的體內(nèi)評估
3）仿生雙層顱腦貼片SMB6可抑制腦外傷后腦水腫，具有神經(jīng)保護功能
在損傷第3天，在左半球的體感和視覺皮層形成局灶性界限清晰的壞死區(qū)域和明顯的深褐色片狀出血灶，且相較于其他組SMB6組淤血較少損傷面積較小。隨經(jīng)14天的治療后，材料治療組損傷面積明顯小于空白對照組，且負載M-CSF和IL-6的SMB6治療組效果最好。T2加權(quán)磁共振成像也顯示SMB6組水腫擴散較淺相較于SMS組略有緩解。研究者通過免疫熒光染色來進一步在細胞層面評估腦損傷的恢復(fù)情況。TBI后第7天和第14天，Control 組損傷皮質(zhì)區(qū)域NeuN陽性細胞數(shù)量明顯減少相較于其他組，證明SMB6負載的M-CSF和IL-6的神經(jīng)保護功能且顯著改善神經(jīng)元的丟失。
圖5 SMB6對炎癥微環(huán)境改善作用的評價
4）SMB6的治療改善炎癥微環(huán)境，促進組織修復(fù)小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生，并減少反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞增生
研究者對不同組小鼠治療第14天腦部進行免疫熒光染色以更直觀地觀察到腦部各項炎癥因子的變化。研究者發(fā)現(xiàn)對照組大鼠海馬組織高度腫脹，GFAP陽性細胞增多。與Sham組相比，SMB6組僅在受損的實質(zhì)中顯示輕微的星形膠質(zhì)細胞形成。此外，研究者進一步探討了小膠質(zhì)細胞在治療后是否支持內(nèi)源性修復(fù)。他們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，受損皮質(zhì)中Iba-1和CD206陽性細胞(M2型細胞)更多，表明SMB6改善了腦組織中的炎癥微環(huán)境。
圖6 SMB6對小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)作用的評價
5）仿生雙層3d打印顱-腦補片的治療對惡化的神經(jīng)功能修復(fù)起到了極大的促進作用
研究者對小鼠的運動、探索、認知、學(xué)習(xí)和記憶能力進行了綜合測試。SMB6治療后，小鼠前肢握力/重量參數(shù)在第14天顯著高于對照組。在新物體識別實驗中，SMB6組小鼠與對照組相比表現(xiàn)出顯著差異，說明SMB6組小鼠具有更強的探索和認知能力。研究者利用Morris水迷宮進一步研究SMB6對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。在學(xué)習(xí)期間，控制組尋找平臺的時間更長，尋找平臺的距離也更長。在定位實驗中，SMB6組探索目標(biāo)象限的時間和穿越平臺的頻率明顯高于對照組，說明SMB6處理顯著提高了小鼠的空間記憶能力。
圖7 SMB6對小鼠血管修復(fù)作用的評價
6）SMB6治療可改善血管功能
研究者發(fā)現(xiàn)Control組小鼠腦損傷實質(zhì)呈現(xiàn)多處瘀斑出血區(qū)域、血管局部腫脹畸形和不連續(xù)的微血管結(jié)構(gòu)；SMS組呈現(xiàn)曲折和腫脹的微血管結(jié)構(gòu)；然而，SMB6組僅呈現(xiàn)出略微腫脹的微血管結(jié)構(gòu)相較于假手術(shù)組（Sham）。各組血紅蛋白濃度和血管密度統(tǒng)計均顯示與Sham組相似的正常水平。此外，研究者檢測CBF以進一步評估血管功能的變化，他們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，SMB6組損傷皮質(zhì)血流速度增加。
圖8 SMB6治療促進TBI修復(fù)的機制
7）SMB6可促進神經(jīng)元的產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)
研究者發(fā)現(xiàn)SMB6通過調(diào)節(jié)突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子通道、白細胞、巨噬細胞和凋亡相關(guān)信號通路，改善腦神經(jīng)炎癥微環(huán)境，SMB6組細胞凋亡相關(guān)指標(biāo)較少，神經(jīng)行為指標(biāo)較好，SMB6組促進了神經(jīng)元祖細胞、神經(jīng)管形成細胞的生長，促進了無髓星形膠質(zhì)細胞的衰老。
圖9 SMB6在大鼠顱骨組織再生中的作用評價
8）仿生雙層顱-腦補片具有良好的骨再生潛能
研究者發(fā)現(xiàn)，在大鼠顱骨缺損模型中，經(jīng)過12周治療后，SMB6組缺損區(qū)域急劇縮小，且缺損部位表面覆蓋大量新生骨組織。為了進一步評估補片的骨再生功能，研究者對缺損部位組織進行HE染色、蕃紅固綠染色（SO）和免疫組化染色，他們發(fā)現(xiàn)治療組呈現(xiàn)更多的骨橋蛋白（OPN）和骨鈣素（OCN）表達。表明顱-腦補片通過上調(diào)OPN和OCN的表達介導(dǎo)骨組織再生。
相關(guān)工作以“A Novel 3D Printed Bi-layer Cranial-brain Patch Promotes Brain Injury Repair and Bone Tissue Regeneration”為題發(fā)表在《Advanced Functional Materials》上，暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系郭瑞研究員為論文通訊作者，碩士生周莉明為第一作者。
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202314330
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